检测甲氰菊酯的试纸及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测甲氰菊酯的试纸及其应用。试纸包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上，所述反应膜(3)上具有包被有甲氰菊酯半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)包被有甲氰菊酯单克隆抗体‑胶体金标记物。本发明专利技术提供的试纸可用于茶叶中甲氰菊酯的残留检测，操作简单、灵敏度高、检测所需时间短、成本低，适合大量样品的筛查和现场监控。

Test paper for detecting fenpropathrin and its application

The present invention discloses a test paper for detecting fenpropathrin and its application. The test paper includes sample absorption pad (1), conjugate pad (2), the reaction film (3), (4) and the bottom absorbent pad (7), the sample absorption pad (1), conjugate pad (2), the reaction film (3), (4) followed by paste absorbent pad at the bottom (7), the reaction film (3) with packet detection line by fenpropathrin hapten carrier protein conjugates (5) and the control line is coated with Goat anti mouse antibody (6), the conjugate release pad (2) coated with a cypermethrin monoclonal antibody colloidal gold marker. The test paper provided by the invention can be used for detecting residue of fenpropathrin in tea, and has the advantages of simple operation, high sensitivity, short detection time and low cost, and is suitable for screening and on-site monitoring of a large number of samples.

【技术实现步骤摘要】
检测甲氰菊酯的试纸及其应用
本专利技术属于快速检测
，具体涉及一种检测甲氰菊酯的试纸，其特别适用于茶叶样品中甲氰菊酯的检测。
技术介绍
甲氰菊酯(Fenpropathrin)，α-氰基-苯氧基苄基-2,2,3,3-四甲基环丙烷羧基酸酯，又名灭扫利，是一种拟除菊酯类杀虫杀螨剂。甲氰菊酯属于神经毒剂，能作用于昆虫的神经系统，使昆虫过度兴奋、麻痹而死。近年来，拟除虫菊酯类农药因具有除虫高效优点而得到普遍使用，其中的甲氰菊酯在食品中时有检出，甲氰菊酯对高等动物具有中等毒性。目前甲氰菊酯残留的检测主要为液相色谱、气相色谱和气相色谱-质谱法等，仪器方法具有检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时长，并且仪器检测需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员，其推广应用受到一定限制。胶体金免疫层析法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品检测等优点，是理想的快速筛选手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测灵敏度高、操作简便、成本低、检测时间短的检测甲氰菊酯的试纸及其应用。本专利技术所提供的检测甲氰菊酯的试纸，包括样品吸收垫1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4和底板7，所述样品吸收垫1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4依次粘贴在底板7上，所述反应膜3上具有包被有甲氰菊酯半抗原－载体蛋白偶联物的检测线5和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线6，所述结合物释放垫2包被有甲氰菊酯单克隆抗体－胶体金标记物。所述结合物释放垫2叠放于样品吸收垫1下，并且结合物释放垫2的1/3被覆盖于样品吸收垫1下。所述甲氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物由甲氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺蛋白。所述甲氰菊酯半抗原是由甲氰菊酯与间羟基苯甲醛、氰化钾、甲氰菊酰氯、对羟基苯丙酸反应合成得到，所示甲氰菊酯半抗原结构式如式(Ⅰ)所示，所述甲氰菊酯单克隆抗体是以甲氰菊酯半抗原－载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述羊抗鼠抗抗体是由鼠源抗体免疫羊得到的。本专利技术的另一个目的是提供一种上述试纸的制备方法，其主要包括以下步骤：a)制备包被有甲氰菊酯单克隆抗体－胶体金标记物的结合物释放垫2；b)制备具有包被有甲氰菊酯半抗原－载体蛋白偶联物的检测线5和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线6的反应膜3；c)将a)和b)制备好的结合物释放垫2、反应膜3与样品吸收垫1、吸水垫4和底板7组装成试纸。本专利技术检测甲氰菊酯的试纸采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将甲氰菊酯单克隆抗体－胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的甲氰菊酯在流动过程中，先与结合物释放垫上的甲氰菊酯单克隆抗体－胶体金标记物，形成药物－抗体－胶体金标记物。样品中的药物与反应膜检测线上的甲氰菊酯半抗原－载体蛋白偶联物竞争结合甲氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中甲氰菊酯残留量，对茶青样品检测限为1mg/kg，对干茶样品检测限为2mg/kg。检测时，样品经处理后滴入试纸卡孔内，当甲氰菊酯在样品中的浓度低于检测限或为零时，甲氰菊酯单克隆抗体－胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的甲氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T线)和质控线(C线)内各出现一条红色条带；如果甲氰菊酯在样品中的浓度等于或高于检测限，甲氰菊酯单克隆抗体－胶体金标记物会与甲氰菊酯全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与甲氰菊酯半抗原－载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。本专利技术的试纸具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、储存简单、保质期长、适用范围广、易于推广应用等优点。附图说明图1为本专利技术甲氰菊酯半抗原合成路线图；图2甲氰菊酯半抗原鉴定图(氢谱图)；图3甲氰菊酯半抗原鉴定图(碳谱图)；图4为本专利技术试纸剖面结构示意图；图5为本专利技术试纸检测结果判定图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。本专利技术试剂如无特别说明，均为常规试剂。实施例1检测甲氰菊酯的试纸的制备该试纸的制备方法主要包括以下几个步骤：a)制备包被有甲氰菊酯单克隆抗体－胶体金标记物的结合物释放垫2；b)制备具有包被有甲氰菊酯半抗原－载体蛋白偶联物的检测线5和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线6的反应膜3；c)将a)和b)制备好的结合物释放垫2、反应膜3与样品吸收垫1、吸水垫4和底板7组装成试纸。下面分步详细叙述：1、甲氰菊酯半抗原的制备，合成路线见图11)合成间苯氧基苯氰醇将1.22g间羟基苯甲醛溶于50mL四氢呋喃中，冰浴搅拌下缓慢加入0.65g氰化钾和0.76mL去离子水，继续搅拌30min后，缓慢滴加2.1mL2mol/L浓盐酸，继续搅拌1h，TLC法检测反应过程，反应结束后，往反应液中加50mL去离子水，用二氯甲烷提取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，得黄色油状液体产物；2)间羟基苯甲氰醇接甲氰菊酰氯将上一步所得产物溶于50mL丙酮中，冰浴搅拌冷却，另取3.54g甲氰菊酰氯溶于50mL二氯甲烷，加入到上述产物的丙酮溶液中，再加入2.14mL嘧啶，混合物继续冰浴反应3h，反应完全后，依次用3mol/L盐酸和去离子水洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得黄色油状液体；3)合成甲氰菊酯半抗原将上一步产物溶于100mL98％浓硫酸，再加入1.66g对羟基苯丙酸，100℃加热回流反应6h，TLC检测，反应完全后，将反应液倒入冰中，用固体碳酸氢钠调节pH至5.0，用乙酸乙酯提取，无水硫酸钠干燥，产品用硅胶柱层析提纯，收集目标组分，经核磁共振氢谱确证，图2中12ppm左侧附近的峰为半抗原连接臂末端羧基上的氢，7ppm附近的一簇峰为甲氰菊酯苯环上的氢和氰基α位碳上的氢，图3所示碳谱图中，110-140ppm之间的峰为甲氰菊酯上两个苯环和氰基上的碳，170-180ppm之间左边的峰为连接臂末端羧基上的碳，右边的峰为甲氰菊酯分子中酯结构上的碳，表明半抗原合成成功。2、免疫原制备－甲氰菊酯半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原称取40mg甲氰菊酯半抗原溶解于3mLDMF溶液中，加入80mgEDC和80mgNHS(二者溶于3mL去离子水中)进行活化30min，将活化甲氰菊酯加入到180～400mgBSA(溶于7mL去离子水)中进行偶联制备出免疫原，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，以除去未反应的小分子物质，即得到免疫原，分装，于-20℃保存备用。3、包被原的制备－甲氰菊酯半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原称取20mg甲氰菊酯半抗原用1.5mLDMF溶解，冷却至10℃时得到反应液Ⅰ；取氯甲酸异丁酯15μL加入反应液Ⅰ中，10℃条件下搅拌反应30min；取45mg卵清蛋白，用3mL50mmol/LNa2CO3溶解，10℃反应4h，转移4℃冰箱过夜；用0.01mol/L磷酸盐缓冲液4℃透析3天，以除去未反应的小分子物质，即得到包被原，分装，于-20℃保存备用。4、甲氰菊酯单克隆抗体的制备1)动物免疫将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为120μg/只，使其产生抗血清。2)细胞融合和克隆化小鼠血清测定结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测甲氰菊酯的试纸，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上，其特征在于所述反应膜上具有包被有甲氰菊酯半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)包被有甲氰菊酯单克隆‑胶体金标记物。

【技术特征摘要】
1.一种检测甲氰菊酯的试纸，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上，其特征在于所述反应膜上具有包被有甲氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)包被有甲氰菊酯单克隆-胶体金标记物。2.如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述结合物释放垫(2)叠放于样品吸收垫(1)下，并且结合物释放垫(2)的1/3被覆盖于样品吸收垫(1)下。3.如权利要求1或2所述的试纸，其特征在于所述甲氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物由甲氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺蛋白。4.如权利要求3所述的试纸，其特征在于所述甲氰菊酯半抗原是由甲氰菊酯与间羟基苯甲醛、氰...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯才伟，汪善良，扶胜，崔海峰，冯静，徐念琴，杨梅，袁学伟，王江政，袁光宇，罗维超，徐明慧，杨昌松，冉茂乾，王吉平，
申请(专利权)人：贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州,52