美洲短吻鳄白蛋白的分离方法技术

本发明专利技术提供一种美洲短吻鳄白蛋白的分离纯化方法。所述方法是以美洲短吻鳄(American Alligator)新鲜血液为原料，通过以下步骤提取的：将新鲜鳄鱼血液进行抗凝处理，分离血浆；硫酸铵沉淀法粗提蛋白；疏水色谱法纯化得到白蛋白；质谱仪对所得蛋白进行鉴定。本发明专利技术方法操作简便易行，成本低廉，纯化得到的鳄鱼血白蛋白纯度很高，填补了国内鳄鱼血浆蛋白成分分离纯化的空白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及美洲短吻鳄(American Alligator)血液提取物的分离方法，属生物

技术介绍
鳄鱼是迄今发现活着的最早和最原始的动物之一。出现于三叠纪至白垩纪的中生代(约两亿年前)性情凶猛的脊椎类爬行动物，是一种科研价值、生态价值、经济价值极高的野生动物。鳄鱼血含有比当今所发现的一切抗生素都要强有力的抗菌物质，不仅可以杀伤病菌，还可以消灭霉菌或是部分种类的病毒。而白蛋白在动物体内具有多种生理作用，比如维持胶体渗透压、物质结合和转运、协调血管内皮完整性、抗氧化以及损伤修复等等。对于鳄鱼血白蛋白以及鳄鱼血液中其他组分的研究具有重要意义，是鳄鱼血抗菌抗病毒机理研究的重要组成部分。硫酸铵能够破坏溶液中蛋白质的水化膜，可以使蛋白质发生沉淀。不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，盐析沉淀所需要的硫酸铵浓度不同，从而达到将蛋白质分离的目的。硫酸铵沉淀的优点是不会使蛋白质发生变性。蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水色谱是利用蛋白质表面某一部分具有的疏水性，使之与也带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。本专利技术操作简便易行，成本低廉；纯化得到的鳄鱼血白蛋白纯度很高，可以达到95%以上；操作过程不经过蛋白变性，白蛋白本身具有良好的活性。目前国内有关鳄鱼血液成分蛋白分离纯化的专利仍然是一个空白，国内国外也从未有过鳄鱼血白蛋白分离提取的相关报道。本专利技术是专利技术人通过大量实验，针对目标蛋白的结构与空间构象，不断优化得到的最简单高效的鳄鱼血白蛋白纯化方法，为同类蛋白的纯化提取提供了一个崭新的思路。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种美洲短吻鳄白蛋白的分离纯化方法。本专利技术目的是通过以下技术方案实现的。本专利技术是以美洲短吻鳄(American Alligator)新鲜血液为原料，通过以下步骤提取的:a.将新鲜鳄鱼血液进行抗凝处理，分离血浆；b.硫酸铵沉淀法粗提蛋白；c.疏水色谱法纯化得到白蛋白；d.质谱仪对所得蛋白进行鉴定。所述步骤a可按如下方法操作:事先以肝素钠溶液润湿容器，以20IU/ml肝素钠的终浓度将其与鳄鱼血液混合，静置Ih ;将静置后的血液进行离心，3000rpm 4°C 5min，吸出上清保存，得到鳄鱼血浆。如需长时间保存，需放置于_20°C或_80°C冰箱。所述步骤b硫酸铵沉淀法按如下方法操作:I)将鳄鱼血浆置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至鳄鱼血浆中硫酸铵浓度达到30%，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm 4°C离心20min，收集上清液；2)将步骤I)中的上清液置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至硫酸铵浓度达到50%，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm 4°C离心20min，收集上清液；3)将步骤2)中的上清液置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至硫酸铵浓度达到70%，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm 4°C离心20min，弃去上清液，收集沉淀蛋白。4)将70%硫酸铵沉淀蛋白溶解于一定体积0.01M, pH = 7的PBS缓冲液，以备后用。 所述步骤c疏水色谱法按如下方法操作:本纯化方法所用仪器为AKTA蛋白纯化系统，色谱柱选择GE公司的HiTrap OctylFF, Iml疏水色谱柱。事先将步骤b所述的70%硫酸铵沉淀蛋白与含有2M硫酸铵的0.01M, pH = 7的PBS缓冲溶液进行等体积混合，保证其硫酸铵浓度约为IM ;使用含有IM硫酸铵的0.01M, pH=7的PBS缓冲溶液平衡色谱柱，设置流速为0.5-lml ;待仪器各条曲线稳定后，将混有硫酸铵的70%硫酸铵沉淀蛋白溶液上样，流穿色谱柱；以1-OM硫酸铵的线性梯度PBS缓冲溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，即为所得。由图2SDS-PAGE电泳图可得，洗脱部分蛋白纯度很高，可以达到95%以上。至后质谱仪分析蛋白，确定为鳄鱼血白蛋白成分。本专利技术的意义在于1.以前国内没有鳄鱼血浆成分分离纯化方面的专利，本专利技术填补了国内鳄鱼血浆蛋白成分分离纯化的空白；2.本专利技术方法操作简便易行，成本低廉，纯化得到的鳄鱼血白蛋白纯度很高，由图2可以看出，白蛋白纯度可以达到95%以上。【附图说明】图1为硫酸铵沉淀法分离美洲短吻鳄血浆蛋白样品SDS-PAGE电泳图:I 为 Thermo PageRuler Prestained Protein Ladder，上样量 5ul，货号 26616 ;2为30%硫酸铵沉淀蛋白，浓度500ug/ml，上样量20ul ；3为50%硫酸铵沉淀蛋白，浓度500ug/ml，上样量20ul ；4为70%硫酸铵沉淀蛋白，浓度500ug/ml，上样量20ul ；5为鳄鱼血浆原蛋白，浓度500ug/ml，上样量20ul。图2为疏水色谱法分离70 %硫酸铵沉淀蛋白SDS-PAGE电泳图:I 为 Thermo PageRuler Prestained Protein Ladder，上样量 5ul，货号 26616 ;2为蛋白流穿部分，浓度200ug/ml，上样量20ul ;3 为 Thermo PageRuler Prestained Protein Ladder，上样量 5ul，货号 26616 ;4为蛋白洗脱部分，浓度200ug/ml，上样量20ul。图3为疏水色谱法洗脱部分蛋白质谱分析结果，结果显示所测成分为鳄鱼血白蛋白。实施方式1.血浆准备本鳄鱼血浆购自广州番禺某鳄鱼养殖场，鳄鱼种类为美洲短吻鳄(Ameri canAlligator)。采血前事先在无菌容器内加入肝素钠溶液，并不断翻倒容器以使肝素钠溶液与容器壁充分接触。宰杀鳄鱼后迅速将新鲜鳄鱼血液灌入容器，并轻轻晃动容器以使肝素钠溶液与鳄鱼血液充分混匀。鳄鱼血液加入不能过多，须保证肝素钠比重大于20IU/ml。灌装鳄鱼血液后，不能剧烈晃动容器，避免血细胞破裂造成凝血。离心鳄鱼血液，3000rpm 4°C 5min，小心吸出上清，即为鳄鱼血清。立即置于_20°C或者-80 °C冰箱冷藏，以干冰制冷密封运输。2.硫酸铵沉淀法分离鳄鱼血浆蛋白I)将鳄鱼血浆置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至鳄鱼血浆中硫酸铵浓度达到30%，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm 4°C离心20min，收集上清液，并保留鳄鱼血30%硫酸钱沉淀蛋白；2)将步骤I)中的上清液置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至硫酸铵浓度达到50%，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm 4°C离心20min，收集上清液，并保留鳄鱼血50%硫酸铵沉淀蛋白；3)将步骤2)中的上清液置于冰上，把硫酸铵粉末缓慢加入其中，并不断震荡混匀，直至硫酸铵浓度达到70%，冰上静置，每静置15min震荡15s，震荡4次后5000rpm 4°C离心20min，弃去上清液，收集鳄鱼血70%硫酸钱沉淀蛋白；4)将鳄鱼血30%硫酸铵沉淀蛋白、50%硫酸铵沉淀蛋白、70%硫酸铵沉淀蛋白分别溶解于一定体积0.01M, p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种美洲短吻鳄血浆白蛋白的分离方法，其特征是以美洲短吻鳄(American Alligator)新鲜血液为原料，分离步骤如下：a.将新鲜美洲短吻鳄血液进行抗凝处理，分离血浆；b.硫酸铵沉淀法粗提蛋白；c.疏水色谱法纯化得到白蛋白；d.质谱仪对所得蛋白进行鉴定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李泽琳，何淼，罗长莉，刘伟，曾毅，
申请(专利权)人：北京工业大学，李泽琳，
类型：发明
国别省市：北京;11