本发明专利技术涉及一种恩诺沙星抗原合成方法及恩诺沙星-IgY抗体制备方法。恩诺沙星抗原合成方法，包括(1)分别称取5mg恩诺沙星、10mgNHS、15mgEDC溶解于1ml的DMF中，搅拌获得反应液，将反应液以离心去沉淀制成恩诺沙星活化中间产物；(2)称取10mg的牛血清白蛋白溶于5ml的PBS中，边搅拌边将恩诺沙星活化中间产物逐滴加入到溶液中；(3)将反应液置于透析袋中；(4)将透析袋内液体离心，去沉淀，即得到恩诺沙星抗原。恩诺沙星-IgY抗体制备方法，所包括以下步骤(1)合成恩诺沙星抗原，(2)制备含抗体的免疫蛋，(3)将收集的蛋分离，得到卵黄和卵清，提取卵黄获得恩诺沙星-IgY抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域中的特异性IgY的制备和应用，具体涉及一种恩诺沙星 抗原合成方法及恩诺沙星-IgY抗体制备方法。
技术介绍
恩诺沙星为合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，为畜禽和水产专用的喹诺酮类抗菌 药物，具有抗菌谱广、渗透性强、价格低廉等优点，被广泛应用于畜禽和水产疾病预防和治 疗。但是其长期使用会产生不良反应，同时畜禽类产品中残留的问题也变得日益突出。 目前有些国家和组织已经禁止其使用，有些国家也对其在畜禽产品中的残留量进 行了规定。而在我国针对畜禽食品中恩诺沙星的残留检测的标准还不健全，因此建立一套 快速、简便、准确的针对畜禽产品中恩诺沙星残留的方法具有重要的意义。 现阶段，针对恩诺沙星残留的检测以高效液相色谱法（HPLC)、超高效液相色谱 (UPLC)法等理化手段为主，这些方法虽然灵敏度较高，但是相应的成本也较高，对专业技术 要求较高，并不适合大量样本的快速检测，而以ELISA为基础建立的检测方法操作简便、快 速、灵敏、不需要专业人员操作，具有良好的发展前景。 卵黄抗体（egg yolk antibody，IgY)抗体是通过对禽类（鸡）免疫注射特定抗原， 从而在体内产生IgY，经血液由母体传递到卵黄内，在卵黄中富集，进而通过分离卵黄，获得 的特异性多克隆抗体。相对于从哺乳动物血清中获得抗体，避免了常规的动物采血，减轻了 动物的痛苦，同时通过卵黄获得抗体，产量大，制备简单，每枚蛋中可以提纯50~100mg的 抗体，且母鸡易于饲养，费用低，便于大规模的生产特异性抗体，经济优势明显。 与哺乳动物免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)相似，IgY的Fab片段包含抗 原结合位点，Fc片段包含的位点有补体激活功能、调理素作用和致敏过敏反应作用等功能。 但是其结构同哺乳动物有些不同，相对于IgG，IgY重链的氨基酸残基数量多于IgG，且重链 恒定区（CH区）数量多于IgG，而轻链小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG， 使IgY相对于IgG更适合用于治疗制剂。IgY等电点（PI)在5. 7~7. 6之间，在pH4. 0~ 11. 0时IgY稳定，比兔IgG对酸变性更为敏感，当pH值从4降到3时，IgY活性迅速丧失， 而IgG对此只受到微小影响；IgY在低温下储存时性能较稳定，室温下可保持6个月的活 性，4°C储存6 ~7年活性下降仅 5% (Jaradat Z W，Marquardt R R.2000.Studies on the stability of chicken IgY in different sugars, complex carbohydrates and food materials. Food and Agricultural Immunology，12(4) :263_272) ;IgY抗胃蛋白酶消化的 稳定性较牛IgG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力则较强（Shimizu M，Nagashima H，Sano K, et al. 1992. Molecular stability of chicken and rabbit immunoglobulin G. Biosci Biotechnol Biochem，56(2):270-274)〇 由于哺乳动物和鸡抗体特异性的差异，相对于哺乳动物IgG，卵黄抗体应用于检测 也具有多方面的优势如：卵黄抗体与风湿因子、人类抗鼠抗体（HAMA)没有交叉反应，无补 体系统活性和异质性凝集素，且不结合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反应。此外，禽类针对 保守性强的蛋白质往往能引发较哺乳动物抗体更强烈的抗体反应，成为有关抗体研发的重 要选择因素。
技术实现思路
专利技术目的：鉴于现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于公开了恩诺沙星抗原 合成方法。本专利技术的第二个目的在于公开了恩诺沙星-IgY抗体制备方法。 技术方案：恩诺沙星抗原合成方法，包括以下步骤： (1)分别称取5mg恩诺沙星、lOmgNHS、15mgEDC溶解于1ml的DMF中，室温下在磁 力搅拌器上搅拌24h，获得反应液，将反应液以2000r/min离心10min，去沉淀，制成恩诺沙 星活化中间产物； ⑵称取l〇mg的牛血清白蛋白，溶于5ml的pH为7. 4的PBS中，在磁力搅拌器上 边搅拌边将步骤（1)得到的恩诺沙星活化中间产物逐滴加入到牛血清白蛋白-PBS溶液中， 室温下在磁力搅拌器上搅拌12~16h得到反应液； (3)将步骤（2)得到的反应液置于透析袋中，透析袋的透析液PBS，4°C透析48h，每 隔8h换透析液一次； (4)透析结束后，将透析袋内液体离心，去沉淀，即得到恩诺沙星抗原。 恩诺沙星-IgY抗体制备方法，所述方法包括以下步骤： (1)合成恩诺沙星抗原， (11)分别称取5mg恩诺沙星、lOmgNHS、15mgEDC溶解于1ml的DMF中，室温下在磁 力搅拌器上搅拌24h，获得反应液，将反应液以2000r/min离心10min，去沉淀，制成恩诺沙 星活化中间产物； (12)称取10mg的牛血清白蛋白，溶于5ml的pH为7.4的PBS中，在磁力搅拌器 上边搅拌边将步骤（11)得到的恩诺沙星活化中间产物逐滴加入到牛血清白蛋白-PBS溶液 中，室温下在磁力搅拌器上搅拌12~16h得到反应液； (13)将步骤（12)得到的反应液置于透析袋中，透析袋的透析液PBS，4°C透析48h， 每隔8h换透析液一次； (14)透析结束后，将透析袋内液体离心，去沉淀，即得到恩诺沙星抗原； (2)制备含抗体的免疫蛋， (21)、向20周禽类初次注射步骤（14)合成得到的恩诺沙星抗原，抗原用量为 300 y g/只，此后的12周中，每隔三周再进行一次抗原注射，抗原用量为250 y g/只； (22)、收集注射恩诺沙星抗原的禽类所生产的蛋，并做标记于4°C保存； (3)将步骤（22)收集的蛋分离，得到卵黄和卵清，提取卵黄获得恩诺沙星-IgY抗 体。 作为本专利技术中恩诺沙星-IgY抗体制备方法的一种优选方案：步骤（3)包括以下步 骤： (31)收集注射恩诺沙星抗原的禽类所生产的蛋，进行卵黄与卵清分离，收集卵黄， 将10ml卵黄使用20mlPBS稀释得到稀释液； (32)向步骤（31)得到的稀释液中加入1~2ml质量体积比为3. 5%的PEG-6000， 搅拌2~5小时后，室温下置于摇床摇晃30分钟后得到混合液； (33)将步骤（32)得到的混合液离心，收集上清，过滤，向滤液中加入等体积的质 量体积比为8. 5%的PEG-6000,搅拌2~5小时后，室温下置于摇床摇晃30分钟得到混合 液； (34)将步骤（33)得到的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮后 得到重悬液，再向重悬液中加入等体积的质量体积比为12%的PEG-6000,搅拌2~5小时 后，室温置于摇床上摇晃30分钟，再进行离心获得沉淀物； (35)将步骤（34)获得的沉淀物使用1. 2毫升PBS溶解后，先使用透析带进行透 析，再使用PBS透析12~16h，收集透析液中的恩诺沙星-IgY抗体即可。 进一步地，所述禽类为鸡。 进一步地，恩诺沙星-IgY抗体在_20°C保存备用。 有益效本文档来自技高网...
【技术保护点】
恩诺沙星抗原合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别称取5mg恩诺沙星、10mgNHS、15mgEDC溶解于1ml的DMF中，室温下在磁力搅拌器上搅拌24h，获得反应液，将反应液以2000r/min离心10min，去沉淀，制成恩诺沙星活化中间产物；(2)称取10mg的牛血清白蛋白，溶于5ml的pH为7.4的PBS中，在磁力搅拌器上边搅拌边将步骤(1)得到的恩诺沙星活化中间产物逐滴加入到牛血清白蛋白‑PBS溶液中，室温下在磁力搅拌器上搅拌12～16h得到反应液；(3)将步骤(2)得到的反应液置于透析袋中，透析袋的透析液PBS，4℃透析48h，每隔8h换透析液一次；(4)透析结束后，将透析袋内液体离心，去沉淀，即得到恩诺沙星抗原。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张小莺，江雪梅，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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