本发明专利技术提供了一种高通量联合检测丙肝病毒抗原-抗体的试剂，本发明专利技术利用流式细胞术的原理，在不同浓度FITC荧光素标记的微球对应包被抗体和抗原，加入检测样本后，与PE标记的配对抗体和抗原组成三明治夹心结构，在480nm激发光作用下，根据不同浓度荧光素发射光强度不同，能够高通量达到同时检测丙肝抗原和抗体的效果。利用荧光显色效果，增强了反应的灵敏度，同时利用FITC标记微球同时检测抗原和抗体的方式，可以同时对丙型肝炎病毒抗体和核心抗原进行检测。对于丙肝检测更加准确，不会漏检，达到了早发现的效果，对丙肝的预防具有很高的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种高通量联合检测丙肝病毒抗原抗体的试剂
本专利技术属于丙型肝炎检测
，具体涉及一种高通量联合检测丙肝病毒抗原-抗体的试剂。
技术介绍
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)感染而引起的一种全球性传染病。据估计目前全世界有1.7亿丙肝病毒感染者，我国的丙肝感染率大约为30%，目前至少有4000~6000万丙肝患者。其中有80~85%的感染者将发展为慢性丙型肝炎，其中又有20%可发展为肝纤维化，最终有4~5%的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，危害十分严重。目前，尚无针对丙型肝炎病毒的特效治疗药物，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV快速变异而困难重重，短期内难有突破进展。因此，HCV的早期诊断对于筛查HCV传染源、指导临床治疗和预后判断有重大意义。现有HCV在临床上的检测方式主要有PCR检测、丙型肝炎病毒抗体检测和丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒，三种检测方法中，PCR检测方法灵敏度高且结果准确，但是方法操作繁琐，需要的人员技术能力强，不容易在各个医院进行推广；丙型肝炎病毒抗体检测试剂是临床上最常见的一种丙肝检测方法，但是该检测存在一个“窗口期”，即在丙肝的感染初期，病人体内还没有出现免疫性抗体，无法在早期就获得检测结果，造成漏诊的状况；丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂在最近几年开始逐渐被医院所接受，市场占有量也不断增大，但是针对于丙肝病人的后期跟踪检测，没有很好的跟踪效果。
技术实现思路
为了解决上述各种检测方法存在的问题，本专利技术提供一种高通量联合检测丙型肝炎病毒抗体及抗原的试剂。该试剂利用流式细胞术的原理，在不同浓度FITC荧光素标记的微球对应包被抗体和抗原，在加入检测样本后，与PE标记的配对抗体和抗原组成三明治夹心结构，在480nm激发光作用下，不同浓度荧光素发射光强度不同，能够高通量达到同时检测丙肝抗原和抗体的效果。采用荧光检测的原理，提高了检测的灵敏度，可以同时定性检测抗原和抗体，能够确定检测样本中是否具有丙型肝炎病毒的感染，具有很高的临床应用价值。本专利技术是通过以下措施实现的：一种化学发光法联合检测丙型肝炎病毒抗体-抗原试剂，其组分如下：组分1（R1）FITC荧光微球试剂：包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球0.1%-1%；包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球0.1%-1%；Tris12.1g/L；BSA0.5g/L；PC-3000.1%；用去离子水配制，HCl调整pH为7.6。其中FITC高亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素（FITC）溶解到二甲基亚砜中配制1mg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1：1的比例混匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤，15000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到100mL的HEPES缓冲液（0.1M，pH=7.4）中，2-8℃放置，保存。FITC低亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素（FITC）溶解到二甲基亚砜中配制1mg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1：3的比例混匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤，5000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到100mL的HEPES缓冲液（0.1M，pH=7.4）中，2-8℃放置，保存。包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球制备流程：取上述FITC高亮微球1mL，加入1mL含0.005gN-羟基丁二酰亚胺和0.005g碳化二亚胺的碳酸盐缓冲液（0.1M，pH=8.0），室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100μL丙肝核心抗原包被抗体，加入1mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH=7.4），室温震荡孵育4h，加入含01%BSA和0.5%吐温20的溶液1mL，4℃震荡孵育12h，用1mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH=7.4）洗涤离心三次，加入00mL的HEPES缓冲液（0.1M，pH=7.4）中，2-8℃放置，保存。包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球制备流程：取上述FITC低亮微球1mL，加入1mL含0.005gN-羟基丁二酰亚胺和0.005g碳化二亚胺的碳酸盐缓冲液（0.1M，pH=8.0），室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100μL丙肝病毒混合蛋白（NS3、NS4和NS5），各种类浓度比例为1：1：1，加入1mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH=7.4），室温震荡孵育4h，加入含01%BSA和0.5%吐温20的溶液1mL，4℃震荡孵育12h，用1mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH=7.4）洗涤离心三次，加入100mL的HEPES缓冲液（0.1M，pH=7.4）中，2-8℃放置，保存。组分2（R2）PE标记试剂：PE标记的HCV-cAg抗体0.1%-1%；PE标记的NS3蛋白0.1%-1；PE标记的NS4蛋白0.1%-1%；PE标记的NS5蛋白0.1%-1%；Tris12.1g/L；BSA0.5g/L；PC-3000.1%；用去离子水配制，HCl调整pH为7.6。其中PE标记抗体或蛋白制备流程为：（1）巯基化藻红蛋白（phycoerthrinPE）的制备：取600μL的15.5mg/mL盐酸巯醇亚胺（iminothiolanehydrochloride）加到1.2mL的3.6mg/mL的PE（藻红蛋白）中，和1.2mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH6.8）混合，装入透析袋置入50mmol/LpH6.8磷酸盐缓冲液中透析，4℃过夜，再换用50mmol/LpH7.5磷酸盐缓冲液透析6h。（2）PE标记抗体或蛋白：取30μL含3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺（SPDP）1.1mg/mL的乙醇溶液，加入700μL含4.2mg/mL抗体或蛋白的磷酸盐缓冲液（50mmol/L，pH7.5），在室温中反应2.5h。再加入上述巯基化藻红蛋白400μL，室温反应12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，用50mmol/LpH7.5磷酸盐缓冲液4℃透析透析过夜，加入0.01%Na3N3分装，2-8℃放置，保存。清洗液磷酸氢二钠1.974g/L磷酸二氢钾0.224g/L氯化钠0.9g/L吐温-200.5%;所有组分都用去离子水进行溶解，配制成溶液状态。阳性对照丙型肝炎病毒核心抗原1%丙型肝炎病毒抗体（抗NS3）1%丙型肝炎病毒抗体（抗NS4）1%丙型肝炎病毒抗体（抗NS5）1%用小牛血清溶解。阴性对照BSA4%用小牛血清溶解。本专利技术的试剂盒的使用方法如下：（1）根据实验需要准备平底试管，做好编号；（2）在试管中加入15μl阳性对照、阴性对照或样本；（3）用连续移液器在试管中加入30μlR2（PE标记试剂）；（4）置于振荡器上轻轻震荡至彻底混匀后，37℃温育5分钟；（5）用连续移液器在试管中加入30μlR1（FITC荧光微球试剂），加样时要保证荧光微球试剂充分混匀；（6）置于振荡器上轻轻振荡至彻底混匀后，37℃温育5分钟；（7）将试管利用离心机5000r/min离心5min，静置2分钟，然后弧线倾倒上清液；（8）用连续移液器在试管中加入300μl清洗液，置于振荡器上1500~2000rpm震荡20秒，至彻底混匀，重复第（7）操作1次；（9）重复第（8）操作2次；（10）每本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高通量联合检测丙肝病毒抗原抗体的试剂，其特征在于，包括组分1、组分2、清洗液、阳性对照和阴性对照，其具体的组成如下：1）所述组分1为FITC荧光微球试剂，包括以下浓度的组分：包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球 0.1%‑1%；包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球 0.1%‑1%；Tris 12.1g/L；BSA 0.5g/L；PC‑300 0.1%；以上试剂用去离子水配制，HCl调整pH为7.6；其中FITC高亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素溶解到二甲基亚砜中配制1mg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1：1的比例混匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤，15000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2‑8℃放置，保存；FITC低亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素溶解到二甲基亚砜中配制1mg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1：3的比例混匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤， 5000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2‑8℃放置，保存；包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球制备流程：取上述FITC高亮微球1mL，加入1mL 含0.005g N‑羟基丁二酰亚胺和0.005g 碳化二亚胺的pH=8.0的碳酸盐缓冲液，室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100μL丙肝核心抗原包被抗体，加入1mL pH=7.4的磷酸盐缓冲液，室温震荡孵育4h，加入含0.1%BSA和0.5%吐温20的溶液1mL，4℃震荡孵育12h，用1mL pH=7.4磷酸盐缓冲液洗涤离心三次，加入100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2‑8℃放置，保存；包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球制备流程：取上述FITC低亮微球1mL，加入1mL 含0.005g N‑羟基丁二酰亚胺和0.005g 碳化二亚胺的 pH=8.0碳酸盐缓冲液，室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100μL丙肝病毒混合蛋白NS3、NS4和NS5，各种类浓度比例为1：1：1，加入1mL pH=7.4磷酸盐缓冲液，室温震荡孵育4h，加入含0.1%BSA和0.5%吐温20的溶液1mL，4℃震荡孵育12h，用1mL pH=7.4磷酸盐缓冲液，洗涤离心三次，加入100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2‑8℃放置，保存；2）所述组分2由以下浓度的试剂制备而成：PE标记的HCV‑cAg抗体 0.1%‑1%；PE标记的NS3蛋白 0.1%‑1；PE标记的NS4蛋白 0.1%‑1%；PE标记的NS5蛋白 0.1%‑1%；Tris 12.1g/L；BSA 0.5g/L；PC‑300 0.1%；组分2用去离子水配制，HCl调整pH到7.6；其中PE标记抗体或蛋白制备流程为：（1）巯基化藻红蛋白的制备：取600μL的15.5mg/mL盐酸巯醇亚胺加到1.2mL的3.6mg/mL的藻红蛋白PE中，和1.2mL， pH6.8磷酸盐缓冲液， 混合，装入透析袋置入50mmol/L pH6.8 磷酸盐缓冲液中透析，4℃过夜，再换用pH7.5，50mmol/L 磷酸盐缓冲液透析6h；（2）PE标记抗体或蛋白：取30μL含3‑(2‑吡啶二巯基)丙酸N‑羟基琥珀酰亚胺SPDP 1.1mg/mL的乙醇溶液，加入700μL含4.2mg/mL 抗体或蛋白的pH7.5的磷酸盐缓冲液，在室温中反应2.5h；再加入上述巯基化藻红蛋白400μL，室温反应12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，用50mmol/L pH7.5 磷酸盐缓冲液4℃透析过夜，加入0.01%Na3N3分装，2‑8℃放置，保存；3）所述清洗液包括如下浓度的组分：磷酸氢二钠 1.974g/L；磷...
【技术特征摘要】
1.一种高通量联合检测丙肝病毒抗原抗体的试剂，其特征在于，包括组分1、组分2、清洗液、阳性对照和阴性对照，其具体的组成如下：1）所述组分1为FITC荧光微球试剂，包括以下浓度的组分：包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球0.1%-1%；包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球0.1%-1%；Tris12.1g/L；BSA0.5g/L；PC-3000.1%；以上试剂用去离子水配制，HCl调整pH为7.6；其中FITC高亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素溶解到二甲基亚砜中配制1mg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1：1的比例混匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤，15000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2-8℃放置，保存；FITC低亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素溶解到二甲基亚砜中配制1mg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1：3的比例混匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤，5000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2-8℃放置，保存；包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球制备流程：取上述FITC高亮微球1mL，加入1mL含0.005gN-羟基丁二酰亚胺和0.005g碳化二亚胺的pH=8.0的碳酸盐缓冲液，室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100μL丙肝核心抗原包被抗体，加入1mLpH=7.4的磷酸盐缓冲液，室温震荡孵育4h，加入含0.1%BSA和0.5%吐温20的溶液1mL，4℃震荡孵育12h，用1mLpH=7.4磷酸盐缓冲液洗涤离心三次，加入100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2-8℃放置，保存；包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球制备流程：取上述FITC低亮微球1mL，加入1mL含0.005gN-羟基丁二酰亚胺和0.005g碳化二亚胺的pH=8.0碳酸盐缓冲液，室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入...
【专利技术属性】
技术研发人员：甘宜梧，王进，谭柏清，李静，王绮，
申请(专利权)人：山东博科生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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