本发明专利技术涉及人工抗原合成技术，旨在提供一种黄曲霉毒素B1-载体蛋白人工偶联抗原的合成方法。该方法分两步，首先通过与羧甲基羟胺半盐酸盐作用，使其形成具有活性基团的黄曲霉毒素B1肟化物，然后通过碳二亚胺合成法制备黄曲霉毒素B1与载体蛋白的人工抗原偶联物，黄曲霉毒素B1肟化物与载体蛋白进行共价偶联，最后产物通过透析、冷冻干燥得到黄曲霉毒素B1人工偶联抗原。本发明专利技术反应条件温并且简单可行，偶联耗时短，成本低，容易规模化生产和推广应用；合成产物稳定性好，偶联比适宜，长期保存不易降解；合成产物具备较好的免疫原性，可制备特异性识别黄曲霉毒素B1的单克隆或多克隆抗体，对于建立黄曲霉毒素B1相关免疫学检测方法具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人工抗原的合成技术，具体为两步法制备黄曲霉毒素 B1-载体蛋白人 工偶联抗原的合成方法。
技术介绍
黄曲霉素是一类化学结构相类似、由黄曲霉和寄生曲霉等产生的次生代谢产物， 常存于土壤、动植物、各种坚果中，在大豆、玉米、奶制品、食用油等制品中也经常发现存在。 黄曲霉毒素及其衍生物有20多种，它们的基本结构都含有一个二氢呋喃和氧杂萘邻酮（香 豆素），其中二氢呋喃与基本毒性有关，香豆素与致癌作用有关。 天然污染的食品中黄曲霉毒素 B1的污染最严重、最普遍、毒性最强，也是目前所发 现的致癌力最强的物质之一，被世界卫生组织划定为I类致癌物，可以造成多器官癌变，如 肝癌、肾癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌及卵巢肿瘤等，特殊也可引起基因突变、DNA损失和畸胎。 鉴于黄曲霉毒素 B1污染可引发各类毒害问题，为严格控制污染状况，进一步提高 食品安全，世界各国都对其在食品中的浓度制定了严格的限量标准，对于奶制品中的黄曲 霉毒素则限量更加严格，特别是婴儿的代乳奶粉中更是不得检出。1966年，食品中黄曲霉毒 素的最高允许量首次被WH0/FA0规定，在英国，消费农产品中AFBl的最高限量标准为4 μ g/ kg，待加工的进口农产品AFB1F能超过10 μ g/kg。我国规定的黄曲霉毒素的限量标准按B1 和Ml分别制定。黄曲霉毒素 V B2、GjP G2的限量标准按照B i制定，在玉米及玉米制品中 的限量标准为20 μ g/kg，在稻谷和植物油脂中的限量标准为10 μ g/kg，在小麦、小麦粉、麦 片、大麦及其他谷物的限量标准均为5 μ g/kg，在婴儿类食品的限量标准为0. 5 μ g/kg。因 此，为保障食品安全，建立特异性针对黄曲霉毒素 B1的检测方法显得非常必要。 目前，黄曲霉毒素队的检测方法主要有薄层色谱法（TLC)、高效液相色谱法 (HPLC)和相关免疫学检测方法（主要包括酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析试纸条）。 其中TLC方法具有操作简单，不需要复杂精密的仪器设备，缺点是灵敏度较低，无法做到痕 量检测；HPLC虽然灵敏度符合要求，但样品前处理繁琐、仪器设备昂贵、需要严格的操作环 境以及专业的操作人员，从而限制了该方法在临床检测中的推广和应用；酶联免疫方法具 有较高的灵敏度和特异性、对待检样本的纯度要求不高、操作简单、只需借助常规酶标仪进 行读数，特别适合于大批量样本的检测，便于基层的推广使用，近年来被广泛应用于黄曲霉 毒素 B1的快速定量检测；该法操作简单、灵敏度高且无需任何仪器读数可用肉眼直接观测 结果，可用于食品及农产品中黄曲霉毒素总量的初步筛查。 免疫学检测方法的核心是抗原抗体特异性反应建立相关检测方法关键是获得具 有高度特异性和亲和力的抗体。黄曲霉毒素 B1的分子量是312. 27Da，属于小分子化合物 (分子量< 1000 Da)，属于典型的半抗原即不具有免疫原性，只具有反应原性，无法刺激动 物机体产生特异的抗体，只有将黄曲霉毒素 B1与载体蛋白偶联后，制成人工偶联抗原才能 刺激机体引起免疫反应产生相应的抗体。制备针对小分子化合物的抗体时，选择合适的方 法制备完全抗原，对获得特异性强、亲和力好的抗体尤其重要，因此该专利技术提供的一种黄曲 霉毒素 B1人工抗原的制备方法，对建立黄曲霉毒素 B i灵敏、准确的免疫学检测方法具有重 要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种黄曲霉毒素 B1-载 体蛋白人工偶联抗原的两步合成法。该方法合成的完全抗原免疫原性强，可制备灵敏度高、 特异性强的抗黄曲霉毒素 B1的特异性抗体，该制备方法过程简单，耗时短，合成物的化学性 质稳定，便于大规模生产与推广应用。 为解决技术问题，本专利技术的解决方案是： 提供一种黄曲霉毒素 B1-载体蛋白人工偶联抗原的合成方法，包括以下步骤： (1)黄曲霉毒素队标准品的预处理： 按体积比I : 1将甲醇与吡啶配制成溶剂，然后将2mg黄曲霉毒素 B1加入4ml溶 剂中，涡旋振荡使其完全溶解，得到黄曲霉毒素 B1溶液； (2)黄曲霉毒素 B1肟化物的合成： 向黄曲霉毒素 B1溶液中加入5mg的羧甲基羟胺半盐酸盐（CM0,作为肟化剂），70°C 下搅拌2h，所得产物置于通风橱下自然挥干；然后加 Iml蒸馏水使产物溶解，再以lmol/L 的氢氧化钠溶液调pH至8. 0 ;用5ml的苯分三次抽提体系中未反应的黄曲霉毒素 B1 (AFBl)， 用0. 2mol/L盐酸调pH至3. 0 ;最后用5ml乙酸乙酯分三次抽提沉淀物，置通风橱下自然挥 干，所得干燥物即为黄曲霉毒素 B1肟化物（AFB1O); (3)黄曲霉毒素 B1肟化物的活化： 将黄曲霉毒素 B1肟化物溶解于2ml的二甲基甲酰胺（DMF)中，然后加入8. 9mg的 二环已基碳二亚胺（DCC)和5. Omg的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)作为活化试剂室温磁力搅 拌反应4h ; (4)载体蛋白的预处理： 按照黄曲霉毒素 B1与蛋白载体初始摩尔比为20 : 1称取蛋白载体，将其溶解于 I. 5ml碳酸氢钠缓冲液，碳酸氢钠缓冲液的浓度为0. lmol/L，pH = 9. 5 ; (5)活化后的黄曲霉毒素队肟化物与载体蛋白的偶联反应： 将经活化处理的黄曲霉毒素 B1肟化物溶液逐滴加到经预处理过的载体蛋白溶液 中且边加边混匀，室温下偶联反应2h ; (6)产物的透析纯化： 偶联反应结束后取出反应液，在4°C环境下，以0. 01M、pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液 透析48h，每间隔12h更换透析液；透析完成后，取出透析袋内溶液测定浓度，并进行紫外全 波长扫描，计算偶联比；将溶液冷冻干燥后在_20°C保存，得到黄曲霉毒素 B1-蛋白载体人 工偶联抗原。 本专利技术中，步骤（4)中所述的蛋白载体是卵清蛋白、牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白 或多聚赖氨酸中的任意一种。 本专利技术的实现原理描述： 本专利技术通过两步法合成黄曲霉毒素 B1-载体蛋白人工偶联抗原，首先合成黄曲霉 毒素队肟化物即AFB A，即式（I)所示化合物。式（I)所示化合物为将黄曲霉素 Bl进行结 构改造，最大程度地保留了原有的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团， 将式（I)所示化合物与载体蛋白偶联得到黄曲霉毒素 B1-载体蛋白人工偶联抗原。式（I)所 示化合物与载体蛋白的偶联比具体可为（7-12) :1，所述的偶联比为摩尔比，式（I)所示化 合物与所述载体蛋白具体可通过碳二亚胺法偶联，所述黄曲霉素 B1人工抗原如式（II)所 示。所述黄曲霉素 B1人工抗原可以作为免疫原免疫动物，可获得高特异性的单克隆抗体和 多克隆抗体，方法简便、易行，也可作为包被抗原将包被酶标板，建立黄曲霉毒素间接ELISA 检测方法。由于包被原与免疫原结构上的差异可以进一步提高检测的灵敏度和特异性。 本专利技术中，以牛血清白蛋白BSA为载体蛋白为例，黄曲霉毒素!^和载体蛋白偶联 制备得到黄曲霉毒素队人工偶联抗原的合成路线如下： 与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于： (1)两步法偶联反应温和，能够较好的保证待偶联分子的结构特性；(2)本专利技术的 整个制备过程操作简单，偶联时间短，无需使用复杂或昂贵的仪器设备，易于推广应用；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄曲霉毒素B1‑载体蛋白人工偶联抗原的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)黄曲霉毒素B1标准品的预处理：按体积比1∶1将甲醇与吡啶配制成溶剂，然后将2mg黄曲霉毒素B1加入4ml溶剂中，涡旋振荡使其完全溶解，得到黄曲霉毒素B1溶液；(2)黄曲霉毒素B1肟化物的合成：向黄曲霉毒素B1溶液中加入5mg的羧甲基羟胺半盐酸盐，70℃下搅拌2h，所得产物置于通风橱下自然挥干；然后加1ml蒸馏水使产物溶解，再以1mol/L的氢氧化钠溶液调pH至8.0；用5ml的苯分三次抽提体系中未反应的黄曲霉毒素B1，用0.2mol/L盐酸调pH至3.0；最后用5ml乙酸乙酯分三次抽提沉淀物，置通风橱下自然挥干，所得干燥物即为黄曲霉毒素B1肟化物；(3)黄曲霉毒素B1肟化物的活化：将步骤(2)所得黄曲霉毒素B1肟化物溶解于2ml的二甲基甲酰胺中，然后加入8.9mg的二环已基碳二亚胺和5.0mg的N‑羟基琥珀酰亚胺作为活化试剂，室温磁力搅拌反应4h；(4)载体蛋白的预处理：按照黄曲霉毒素B1与蛋白载体初始摩尔比为20∶1称取蛋白载体，将其溶解于1.5ml碳酸氢钠缓冲液，碳酸氢钠缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝9.5；(5)活化后的黄曲霉毒素B1肟化物与载体蛋白的偶联反应：将经活化处理的黄曲霉毒素B1肟化物溶液逐滴加到经预处理的载体蛋白溶液中，边加边混匀，室温下偶联反应2h；(6)产物的透析纯化：偶联反应结束后取出反应液，在4℃环境下，以0.01M、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液透析48h，每间隔12h更换透析液；透析完成后，取出透析袋内溶液测定浓度，并进行紫外全波长扫描，计算偶联比；将溶液冷冻干燥后在‑20℃保存，得到黄曲霉毒素B1‑蛋白载体人工偶联抗原。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方维焕，章先，李肖梁，谢珲，王歆，孙孟娇，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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