【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了一种mervl-h2b-tdtomato报告细胞系的构建方法，同时还公开了该细胞系相关的制备方法，属于生物。
技术介绍
1、哺乳动物在早期胚胎发生过程中，受精卵发育成多细胞胚胎伴随着发育潜能的缓慢下降。虽然来自于囊胚内细胞团的细胞具有多能性，可以产生三个胚层，但它们缺乏产生胚胎外细胞组织的能力。相反，只有受精卵和来源于2-cell（2c）分裂球的细胞具有最高程度的发育潜能。然而，早期胚胎获取困难，严重阻碍了对全能性干细胞的研究，同时，由于缺乏可靠的培养体系，全能性干细胞在体外很难维持。因此，人们对这一发育阶段的了解不多，也不清楚全能性干细胞在体内和体外的调节机制。在体外培养的多能性小鼠胚胎干细胞（escs）中，存在1% 左右能够表达2c特异转录本和内源性逆转录病毒muerv-l（mervl）的2c样细胞（2 cell-like cells，2clcs），这些细胞具有发育成为胚胎和胚胎外组织的全能性。
2、2clcs和2c胚胎都与mervl激活有关。除了完整的mervl序列，小鼠基因组同时携带37,000- 38,000个mervl-ltr。ltr能够被转录因子识别并发挥启动子或者增强子的功能进而调控基因表达。研究发现，在2clcs中表达也同时在2c胚胎阶段被激活的基因超过500个，其中52个基因产生了与mervl元件相连的嵌合转录本。因此，了解mervl激活的分子机制是揭示全能性状态的关键。目前常用的全能性指示细胞系多采用将报告载体mervl-ltr-tdtomato通过随机整合的方式插入基因组获得。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述局限和不足，实现实时精准观察和研究mervl阳性细胞的表达情况。
2、本专利技术还提供了一种mervl-h2b-tdtomato报告细胞系的构建方法及应用，为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案实现。
3、本专利技术提供的一种mervl-h2b-tdtomato报告细胞系的构建方法及应用，为获得稳定表达荧光蛋白的细胞作为报告细胞，将mervl-h2b-tdtomato敲入到基因组 rosa26位置。
4、本专利技术所述荧光蛋白表达元件构建到打靶载体中，荧光蛋白编码基因为核定位的tdtomato。
5、本专利技术所述打靶载体主要包括上游同源臂(seq id no:1)、mervl(seq id no:2)、h2b(seq id no:3)、tdtomato(seq id no:4)、bgh-polya(seq id no:5)、sv40 promoter(seq id no:6)、hygro (seq id no:7) 、sv40 poly a (seq id no:8)和下游同源臂(seqid no:9)。mervl和荧光蛋白通过h2b连接肽段形成融合蛋白，构建的mervl-h2b-tdtomato报告细胞系发出的荧光直接指示mervl基因的表达水平。
6、本专利技术所述细胞为小鼠胚胎干细胞r1。
7、本专利技术所述细胞系敲入方法采用crispr-cas技术，rosa26 sgrna序列如seq idno:10。
8、本专利技术还提供上述报告细胞系的筛选和鉴定步骤，具体包括以下步骤：
9、a. 含sgrna的表达载体和含mervl-h2b-tdtomato元件的打靶载体共转染r1；
10、b.转染2d后重悬细胞，潮霉素筛选，有限稀释细胞铺板；
11、c. 挑取单克隆细胞，pcr及测序鉴定报告细胞系。
12、本专利技术还提供上述报告细胞系的荧光报告细胞系的功能及报告能力评估：
13、a.在血清/lif培养条件下的r1细胞通过流式检测tdtomato的阳性率在0.25%左右；
14、b. 全能性调控因子如dux可以激活增加r1中的tdtomato阳性率。
15、本专利技术所述的一种mervl-h2b-tdtomato报告细胞系的构建方法，为研究全能性细胞的分子机制、筛选全能性调控关键基因和小分子等的应用提供有效的平台。
16、本专利技术所述的一种mervl-h2b-tdtomato 报告细胞系的构建方法及应用在制备mervl-h2b-tdtomato动物模型中的应用。
17、图1为本专利技术利用crispr-cas9技术敲入mervl-h2b-tdtomato 的原理示意图。
18、图2为本专利技术报告细胞系的pcr鉴定电泳图。
19、图3为本专利技术 mervl-h2b-tdtomato报告细胞系在血清/lif培养条件下过表达dux和未表达dux的荧光显微镜图。
20、图4为本专利技术mervl-h2b-tdtomato报告细胞系在血清/lif培养条件下过表达dux和未表达dux的流式细胞术检测结果。
21、图5为本专利技术mervl-h2b-tdtomato报告细胞系在血清/lif培养条件下过表达dux后筛选得到的tdtomato阳性细胞与阴性细胞全能性相关基因表达谱差异。
22、图6为本专利技术mervl-h2b-tdtomato报告细胞系在血清/lif培养条件下过表达dux后筛选得到的tdtomato阳性细胞与阴性细胞h3k27ac、h3kme3和h3kme1在全能性相关基因上富集差异谱差异。
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1.一种MERVL-H2B-tdTomato报告细胞系的构建方法，其特征在于，为获得表达核定位的荧光蛋白报告细胞，将MERVL-H2B-tdTomato定点敲入到Rosa26基因组位置。
2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述荧光蛋白表达元件构建到重组载体中，荧光蛋白编码基因为核定位的红色荧光蛋白H2B-tdTomato。
3.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，本专利技术的载体主要包括上游同源臂(SEQID NO:1)、MERVL (SEQ ID NO:2)、H2B (SEQ ID NO:3)、 tdTomato (SEQ ID NO:4)、bGH-PolyA (SEQ ID NO:5)、SV40 Promoter (SEQ ID NO:6)、Hygro (SEQ ID NO:7) 、SV40Poly A (SEQ ID NO:8)和下游同源臂(SEQ ID NO:9)。
4.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，细胞为小鼠胚胎干细胞R1。
5.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，敲入方法采用CRISPR-Ca
6.根据权利要求1-5所述的细胞系筛选和鉴定步骤，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求1-6所述的细胞系，其特征在于，荧光报告细胞系的功能及报告能力评估：
8.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述报告细胞系在实时监测全能性细胞的建立过程，研究研究全能性细胞激活和维持的分子机制、小分子和基因筛选等方面的应用。
9.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，在制备MERVL-H2B-tdTomato动物模型中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种mervl-h2b-tdtomato报告细胞系的构建方法，其特征在于，为获得表达核定位的荧光蛋白报告细胞，将mervl-h2b-tdtomato定点敲入到rosa26基因组位置。
2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述荧光蛋白表达元件构建到重组载体中，荧光蛋白编码基因为核定位的红色荧光蛋白h2b-tdtomato。
3.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，本发明的载体主要包括上游同源臂(seqid no:1)、mervl (seq id no:2)、h2b (seq id no:3)、 tdtomato (seq id no:4)、bgh-polya (seq id no:5)、sv40 promoter (seq id no:6)、hygro (seq id no:7) 、sv40poly a (seq i...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨藩，高启丰，康菡，高蕾蕾，郭永超，全梓悦，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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