【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及牛病毒检测试剂及疫苗，具体涉及牛病毒性腹泻病毒抗原蛋白的表达策略、免疫原性评价及血清免疫抗体效价测定。
技术介绍
1、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus,bvdv)是引起牛病毒性腹泻-黏膜病(bovine viral diarrhea-mucosal disease,bvd-md)的病原，属于黄病毒科瘟病毒属。bvd-md临床表现为腹泻、持续性感染、免疫抑制、出血综合征，及生殖障碍和呼吸系统疾病，且急性bvd致死率可高达90％，对养牛业产生了严重的危害。bvd-md防控困难的原因，主要是在感染bvdv的过程中可产生持续性感染和免疫耐受现象；此外，bvdv具有多种基因型和基因亚型，导致病理相对复杂。针对bvd-md尚无高效的治疗方法，主要通过对症疗法和加强护理减轻症状，同时为了减少病毒传播感染，普遍使用疫苗免疫预防及扑杀pi牛等监管方法。因此，研制一种安全有效的预防bvdv感染相关疾病的疫苗具有重大意义。
2、bvdv是单股正链的rna病毒，具有包膜，基因组大小约为12.3kb，开放阅读框编码一个长的多聚蛋白，可被切割成12个成熟的病毒多肽：npro、c、erns、e1、e2、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b。其中c、erns、e1和e2为结构蛋白，其余8个为非结构蛋白。编码bvdvns4b蛋白的基因片段长约1041bp，蛋白分子量约为38kda，呈碱性，是病毒复制酶的组成部分，具有疏水性且具有多种功能，如诱导膜复制系统启动、rna结合和
3、国内外已经报道了针对bvdv多个结构蛋白以及非结构蛋白的亚单位疫苗，但有关ns4b亚单位疫苗的研究还未见报道。已有文献报道了ns5b蛋白的截短表达以及多克隆抗体的制备(秦春雪,夏国建,何成强.牛病毒性腹泻病毒ns5b蛋白的截短表达及多克隆抗体制备.中国动物传染病学报,1-6[2024-01-22])，用其表达的ns5b n端截短体作为抗原蛋白免疫后诱导的抗体效价仍较低。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种截短表达的牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白及其应用。本专利技术通过bvdv ns4b基因截短表达、纯化并验证ns4b蛋白截短体免疫原性、以及在利用ns4b蛋白截短体免疫动物后检测相应抗血清的效价并进行特异性验证，不仅为建立基于ns4b抗原蛋白的bvdv毒株血清学检测方法提供了参考，而且使表达的ns4b抗原蛋白能够诱导较高的抗体水平。
2、为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、一种高表达优势牛病毒性腹泻病毒抗原蛋白筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：
4、根据对牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白全长(即bvdv ns4b蛋白氨基酸序列)进行疏水区域和/或跨膜区的序列结构预测的结果，通过设计牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白的n端或c端截短体消除或弱化ns4b蛋白亲水性氨基酸与疏水性氨基酸的穿插分布，然后将设计的截短体进行原核表达、纯化以及通过sds-page考马斯亮蓝染色进行表达水平验证。
5、优选的，所述筛选方法还包括以下步骤：根据蛋白表达情况同时考虑截短体过短则可能会丢失抗原表位的情况(后者主要影响免疫原性等作为抗原蛋白应用时的性能)，确定ns4b蛋白c端截短体长度，例如ns4b蛋白c端截短体长度不超过147aa(过长会包含更多的疏水区，不利于目的蛋白的表达)。
6、一种病毒抗原蛋白，该抗原蛋白包括牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白截短体，所述ns4b蛋白截短体为长度不超过147aa的ns4b蛋白c端截短体。
7、优选的，所述ns4b蛋白截短体为80～143aa长度的ns4b蛋白c端截短体。
8、优选的，所述ns4b蛋白截短体为143aa长度的ns4b蛋白c端截短体ns4b-c205-347，该ns4b蛋白截短体的氨基酸序列如seq.id.no.5所示。
9、优选的，所述抗原蛋白是通过将牛病毒性腹泻病毒基因组中对应于ns4b蛋白的编码序列的部分进行截短表达后所得，例如以牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白氨基酸序列c端长度143aa的截短体(即上述ns4b-c205-347)为表达的目的蛋白。
10、上述病毒抗原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
11、采用基于基因工程构建的表达系统，将牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白截短体进行原核表达，所述ns4b蛋白截短体为长度不超过147aa的ns4b蛋白c端截短体。
12、优选的，所述病毒抗原蛋白的制备方法具体包括以下步骤：
13、1)根据牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白截短体的氨基酸序列，从ns4b蛋白的编码序列中选取对应的截短的基因片段(例如上述ns4b-c205-347等亲水性更强的c端截短体对应的编码序列)，利用该基因片段构建所述ns4b蛋白截短体的原核表达菌株；
14、2)对所述原核表达菌株发酵培养后进行表达产物分离纯化，得到含有所述ns4b蛋白截短体的目的蛋白。
15、优选的，所述原核表达菌株为经转化用于表达所述基因片段的重组质粒的大肠杆菌。
16、优选的，所述基因片段是通过将所述ns4b蛋白截短体(例如上述ns4b-c205-347等亲水性更强的c端截短体)对应的编码序列进行密码子优化(例如参照大肠杆菌的偏好性)后合成所得。
17、优选的，所述目的蛋白还包括与所述ns4b蛋白截短体融合表达的his标签。
18、一种牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白截短体在制备牛病毒性腹泻病毒病(例如牛病毒性腹泻-黏膜病)疫苗中的应用，所述ns4b蛋白截短体为长度不超过147aa的ns4b蛋白c端截短体(例如上述ns4b-c205-347)。
19、优选的，所述疫苗采用注射免疫，经免疫后可以产生特异性抗体。
20、一种牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白截短体在制备牛病毒性腹泻病毒血清学检测试剂中的应用，所述ns4b蛋白截短体为长度不超过147aa的ns4b蛋白c端截短体(例如上述ns4b-c205-347)。
21、本专利技术的有益效果体现在：
22、本专利技术发现了可以实现高效表达的牛病毒性腹泻病毒抗原蛋白，该抗原蛋白可以通过对牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白进行截短表达获得，不仅制备操作简单，而且经免疫动物后可以诱导较高的抗体水平，在牛病毒性腹泻病毒ns4b亚单位疫苗的开发以及牛病毒性腹泻病毒病的防控中具有广泛应用前景。...
【技术保护点】
1.一种病毒抗原蛋白，其特征在于：该抗原蛋白包括牛病毒性腹泻病毒NS4B蛋白截短体，所述NS4B蛋白截短体为长度不超过147AA的NS4B蛋白C端截短体。
2.根据权利要求1所述一种病毒抗原蛋白，其特征在于：所述NS4B蛋白截短体为143AA长度的NS4B蛋白C端截短体NS4B-C205-347，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。
3.根据权利要求1所述一种病毒抗原蛋白，其特征在于：所述抗原蛋白是通过将牛病毒性腹泻病毒基因组中对应于NS4B蛋白的编码序列的部分进行截短表达后所得。
4.一种病毒抗原蛋白的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述一种病毒抗原蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法具体包括以下步骤：
6.一种用于表达病毒抗原蛋白的重组菌株，其特征在于：所述抗原蛋白包括牛病毒性腹泻病毒NS4B蛋白截短体，所述NS4B蛋白截短体为长度不超过147AA的NS4B蛋白C端截短体。
7.一种牛病毒性腹泻病毒病疫苗或牛病毒性腹泻病毒NS4B亚单位疫苗，其特征在于：包括牛病毒
8.一种牛病毒性腹泻病毒NS4B蛋白截短体在制备牛病毒性腹泻病毒病疫苗或牛病毒性腹泻病毒NS4B亚单位疫苗中的应用，其特征在于：所述NS4B蛋白截短体为长度不超过147AA的NS4B蛋白C端截短体。
9.一种牛病毒性腹泻病毒NS4B蛋白截短体在制备牛病毒性腹泻病毒血清学检测试剂中的应用，其特征在于：所述NS4B蛋白截短体为长度不超过147AA的NS4B蛋白C端截短体。
10.一种高表达优势牛病毒性腹泻病毒抗原蛋白筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种病毒抗原蛋白，其特征在于：该抗原蛋白包括牛病毒性腹泻病毒ns4b蛋白截短体，所述ns4b蛋白截短体为长度不超过147aa的ns4b蛋白c端截短体。
2.根据权利要求1所述一种病毒抗原蛋白，其特征在于：所述ns4b蛋白截短体为143aa长度的ns4b蛋白c端截短体ns4b-c205-347，氨基酸序列如seq.id.no.5所示。
3.根据权利要求1所述一种病毒抗原蛋白，其特征在于：所述抗原蛋白是通过将牛病毒性腹泻病毒基因组中对应于ns4b蛋白的编码序列的部分进行截短表达后所得。
4.一种病毒抗原蛋白的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述一种病毒抗原蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法具体包括以下步骤：
6.一种用于表达病毒抗原蛋白的重组菌株，其特征在于：所述抗原蛋白包括牛病毒性...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐雪峰，赵宝，张颖，李志军，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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