本发明专利技术公开了一种从尿液中制备人血白蛋白的方法。收集已吸附尿蛋白的树脂，进行清洗、解吸处理，收集洗脱峰，超滤浓缩，调节pH和电导，经过金属螯合亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析，制备人血白蛋白。本方法成本低，收率高，无免疫原性，质量稳定，适合大规模生产操作，为白蛋白的来源开辟了一条全新的渠道。
【技术实现步骤摘要】
[0001 ] 本专利技术涉及人血白蛋白的制造领域，尤其涉及。
技术介绍
人血白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是人体血液中最重要的一种功能性蛋白质，其主要生理功能为维持血液渗透压，结合并运输小分子营养物质和药物。HSA是目前用量最大的一种蛋白药物，临床上用于治疗低蛋白血症、慢性肾炎、肝炎、肝硬化和晚期恶性肿瘤等疾病，此外，人血白蛋白还用作赋形剂和稳定剂、生产疫苗的免疫佐剂、无血清细胞培养基的组分等。人血白蛋白主要来源于血浆，据2012年市场统计资料显示，全球每年人血白蛋白需求量达600吨以上，除美国外，其他国家大多数需要依靠部分进口，以满足需求。目前，我国的年需求量约为170吨左右，其中临床用量120吨左右，疫苗生产企业用量约40吨左右，随着我国疫苗需求量的增加，培养基级白蛋白用量迅速扩大，预计未来白蛋白市场需求将升至250吨以上，由于我国血浆供给的制约等因素，市场缺口非常大，因此，进一步扩展白蛋白的来源成为业界亟待 解决的问题。目前，白蛋白的基因工程产品取得了较大的进展，EP0612761、EP0570916、US6638740B1等均公开了纯化重组人血白蛋白的方法，但这些方法制得的白蛋白容易残留微量异源蛋白引起过敏等副反应，存在重组白蛋白生理功能不确定的缺陷容易引起不可知隐患，因此其应用受到严重的限制。资料显示，人尿中也含有白蛋白，其结构、理化性质与人血白蛋白完全一致(刘兰英等，1984，吉林大学自然科学学报，122-126)，因此人尿来源的白蛋白若能得到开发利用，可在一定程度上替代血浆来源的白蛋白，从而缓解白蛋白市场的紧张局面。本专利技术以中国专利ZL201010106302.9为基础，通过树脂在线吸附富集白蛋白等尿蛋白，并通过应用现代层析技术成功实现白蛋白的纯化，成本低，收率高，无免疫原性，质量稳定，适合大规模生产操作，为白蛋白的来源开辟了一条全新的渠道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的不足，提供，成本低，收率高，无免疫原性，SDS-PAGE显示为单一条带，HPLC显示不含多聚体，质量稳定，适合大规模生产操作，为白蛋白的来源开辟了一条全新的渠道。为实现上述目的，本专利技术从尿液中制备人血白蛋白的方法技术方案是: ，收集已吸附尿蛋白的树脂，进行清洗处理，还包括如下步骤: a)尿蛋白解吸附，得到尿蛋白浓缩液； b)采用平衡液平衡好的金属螯合亲和层析柱层析，冲洗液洗脱收集洗脱峰； c)采用平衡液平衡好的阴离子层析柱层析，上样上一步的洗脱峰，冲洗液洗脱收集洗脱峰； d)采用平衡液平衡好的疏水层析柱层析，上样上一步的洗脱峰，冲洗液洗脱收集洗脱峰； e)采用平衡液平衡好的阴离子交换层析，上样上一步的洗脱峰，冲洗液洗脱收集洗脱峰，得到人血白蛋白。步骤a)利用0.5 — 1.5M的NaCl溶液进行尿蛋白的解吸附。步骤d)和步骤e)之间增加一个去病毒步骤，调节步骤d)中的洗脱液蛋白质浓度至20% - 25%，加入辛酸钠作为保护剂，进行60°C加热处理10小时。步骤b)中金属螯合亲和层析柱的螯合金属离子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一种。优选Cu2+。步骤b)中尿蛋白浓缩液上金属螯合亲和层析柱之前超滤浓缩，调节PH4 —8，电导0.5 - 10mS/cm，平衡液为0.02 一 0.2M醋酸盐或磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为0.2 — 2.0M,洗脱液为0.02 - 0.2M磷酸盐溶液，0.5 - 1.5M NH4Cl, pH6.0 — 8.4。平衡液优选0.02M醋酸盐缓冲液，NaCl浓度为0.5M，洗脱液优选配0.02M磷酸盐，1.0M NH4Cl, pH8.0。在洗脱之前加入冲洗步骤，用pH5.0-8.0，NH4Cl浓度0.5M的冲洗液冲洗金属螯合亲和层析柱，所述的冲洗液缓冲介质为0.02 - 0.2M磷酸盐或者醋酸盐。冲洗液优选0.02M 磷酸盐，0.2M NH4Cl, pH6.0。步骤c)中的阴离子层析柱平衡液为0.02 - 0.2M磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，PH5 - 8 ;洗脱液为0.05 - 1.0M磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，pH4 — 8。平衡液优选0.02M磷酸盐缓冲液，PH6.0，洗脱液优选0.5M醋酸盐缓冲液，pH5.0。步骤d)洗脱峰上疏水层析柱之前对洗脱峰进行超滤浓缩液调节pH和电导，PH6 -9，电导 5.0 — IOmS/Cm0步骤d)中的疏水层析柱平衡液为0.02 - 0.2M磷酸盐缓冲液，(NH4) 2S04浓度为0.5 - 2.0M，pH6 — 9，洗脱液为 0.02 — 0.2M 磷酸盐缓冲液，(NH4)2SO4 浓度为 0.2 - 1.0M,PH6 - 9。平衡液优选0.02M磷酸盐缓冲液，(NH4)2SO4浓度为1.5M，pH7.0，洗脱液优选0.02M磷酸盐缓冲液，(NH4) 2S04浓度为0.5M，pH7.0。[0016步骤e)洗脱峰上阴离子交换柱之前对洗脱峰进行超滤浓缩，调节pH6 — 9，电导0.5 — 5.0mS/cm。步骤e)中的阴离子交换层析柱平衡液为0.02 一 0.2M磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为0.1 — 1.0M, pH6 - 9 ;洗脱液为0.02 一 0.2M磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为0.5 — 2.0M,pH6 — 9。平衡液优选0.02M磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为0.2M，pH7.0，洗脱液优选0.02M磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为1.0M, ρΗ7.0。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点: 本专利技术纯化的白蛋白与传统cohn法生产的人血白蛋白理化性质、生物学性质完全一致； 纯人源性产品，无异源蛋白污染，更安全可靠；本专利技术白蛋白产品几乎不含多聚体，控制了内毒素含量，提高了白蛋白的稳定性，纯度比cohn法制得血衆白蛋白闻,可达99%以上，广品各项质量指标均符合国家药典标准；本专利技术利用在线吸附法可富集多种尿蛋白，并通过与乌司他丁、人尿激肽原酶等尿蛋白进行联产，大幅度降低成本，使其更加具有产业化基础； 本专利技术操作方便，适用于大规模生产。【附图说明】图1为本专利技术步骤实施流程图。图2为本专利技术制得的白蛋白纯品SDS-PAGE图。[0021 ] 图3为本专利技术制得的白蛋白纯品HPLC图。图4为市面上在售的人血白蛋白药品肽图。图5为本专利技术制得的白蛋白纯品肽图。 【具体实施方式】下面结合【具体实施方式】，进一步阐明本专利技术，应理解这些实施方式仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。，收集已吸附尿蛋白的树脂，进行清洗、解吸处理。a)利用0.5 — 1.5M的NaCl溶液进行尿蛋白的解吸附； b)洗脱峰超滤浓缩后调节pH4 — 8,电导0.5 — 10mS/cm,上样已平衡好的金属螯合亲和层析柱，平衡液为0.02 - 0.2M醋酸盐或磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为0.2 — 2.0M，用pH5.0-8.0, NH4Cl浓度≤0.5M的冲洗液冲洗，所述的冲洗液缓冲介质为0.02 一 0.2M磷酸盐或者醋酸盐；用0.02 - 0.2M磷酸盐，0.5 - 1.5M NH4Cl, pH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从尿液中制备人血白蛋白的方法，收集已吸附尿蛋白的树脂，进行清洗处理，其特征在于，还包括如下步骤： a）尿蛋白解吸附，得到尿蛋白浓缩液；b)采用平衡液平衡好的金属螯合亲和层析柱层析，冲洗液洗脱收集洗脱峰； c)采用平衡液平衡好的阴离子层析柱层析，上样上一步的洗脱峰，冲洗液洗脱收集洗脱峰； d)采用平衡液平衡好的疏水层析柱层析，上样上一步的洗脱峰，冲洗液洗脱收集洗脱峰； e)采用平衡液平衡好的阴离子交换层析，上样上一步的洗脱峰，冲洗液洗脱收集洗脱峰，得到人血白蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种从尿液中制备人血白蛋白的方法，收集已吸附尿蛋白的树脂，进行清洗处理，其特征在于，还包括如下步骤: a)尿蛋白解吸附，得到尿蛋白浓缩液； b)采用平衡液平衡好的金属螯合亲和层析柱层析，冲洗液洗脱收集洗脱峰； c)采用平衡液平衡好的阴离子层析柱层析，上样上一步的洗脱峰，冲洗液洗脱收集洗脱峰； d)采用平衡液平衡好的疏水层析柱层析，上样上一步的洗脱峰，冲洗液洗脱收集洗脱峰； e)采用平衡液平衡好的阴离子交换层析，上样上一步的洗脱峰，冲洗液洗脱收集洗脱峰，得到人血白蛋白。2.根据权利要求1所述从尿液中制备人血白蛋白的方法，其特征在于，步骤a)利用0.5-1.5M的NaCl溶液进行尿蛋白的解吸附。3.根据权利要求1所述从尿液中制备人血白蛋白的方法，其特征在于，步骤d)和步骤e)之间增加一个去病毒步骤，调节步骤d)中的洗脱液蛋白质浓度至20% - 25%，加入辛酸钠作为保护剂，进行60°C加热处理10小时。4.根据权利要求1所述从尿液中制备人血白蛋白的方法，其特征在于，步骤b)中金属螯合亲和层析柱的螯合金属离子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一种。5.根据权利要求1所述从尿液中制备人血白蛋白的方法，其特征在于，步骤b)中尿蛋白浓缩液上金属螯合亲和层析柱之前超滤浓缩，调节PH4 — 8，电导0.5 — lOmS/cm，平衡液为0.02 — 0.2M醋酸盐或磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为0.2 — 2.0M，洗脱液为0.02 一 0.2M磷酸盐溶液，0...
【专利技术属性】
技术研发人员：苗丕渠，侯晓彦，池正昌，沈小宁，
申请(专利权)人：扬州艾迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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