本申请涉及TET2基因改造、蛋白表达纯化、TET2-5-mC DNA复合物晶体结构及其应用，提供了氨基酸序列如下式所示的多肽：X－L－Y式中，X表示至少含有SEQ ID NO:2第1129-1448位氨基酸残基的SEQ ID NO:2的片段；Y表示至少含有SEQ ID NO:2第1844-1925位氨基酸残基的SEQ ID NO:2的片段；L表示接头序列。所述多肽为TET2蛋白的截短片段。所述多肽可从大肠杆菌中大量提取纯化，具有DNA羟甲基化酶活性，且性质稳定。本发明专利技术还包括所述多肽在检测DNA序列中5-hmC是否存在、催化DNA序列5-mC氧化以及研究TET蛋白与DNA作用机制中的用途。
【技术实现步骤摘要】
本申请属于结构生物学领域，涉及TET2基因改造、蛋白表达纯化、TET2-5-mCDNA 复合物晶体结构及应用。
技术介绍
恶性肿瘤及血液系统疾病很长时间来都是危害人类生命健康的最大杀手，新增的 癌症病例患者死亡率以每年1%的速度递增着。据世界卫生组织（WHO)国际癌症研究机构 推测，截至2030年，全球范围内，确诊癌症的患者数将比21世纪初增加1倍以上，即截止至 2030年，全球将有约2700万人确诊为癌症，约1700万人死于癌症。目前，世界卫生组织和 各国政府卫生部门已把攻克癌症列为一项首要任务。 随着近年来表观遗传学热度的增加，人们越来越意识到表观遗传学在基因组印 记、基因表达调控、胚胎干细胞维持及分化、胚胎发育及成体造血功能、恶性血液疾病及肿 瘤发生中的重要意义。表观遗传学（epigenetics)是研究在DNA碱基序列不变前提下引起 基因表达或细胞表型变化的遗传机制，主要包括DNA(胞嘧啶，cytosine，C)的甲基化、组蛋 白修饰和染色质重塑等。 高等真核细胞DNA甲基化主要为胞嘧啶（C)甲基化，即形成5-甲基胞嘧啶（5-mC)。 5-mC转换为C即为DNA去甲基化。细胞DNA甲基化/去甲基化处于动态平衡状态，以调苄基 因表达及细胞行使功能。DNA甲基化与去甲基化发生均受到严格调控，此调控同个体生长 发育与生理活动调节密切相关，疾病发生时常伴有DNA甲基化调控机制异常所引起的DNA 甲基化修饰紊乱. Cell, 1999,99(3) : 247-257]。DNA甲基化主要由DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase， DNMT)催化。DNA去甲基化包括全基因组范围和特异基因位点DNA的去甲基化，其发生机制 较为复杂，分为被动和主动去甲基化两类。被动去甲基化是指在DNA复制过程中，因DNMT 活性受抑制导致新合成DNA链上甲基化水平随着DNA的复制而被稀释。主动去甲基化则独 立于DNA复制，由相关酶逐步催化5-mC转化为C，主动去甲基化过程中，一方面可由酶催化 5_mC甲基基团的直接切除.NatureReviewsMolecularCellBiology, 2010, 11(9):607_620];另一方 面是利用碱基或核苷酸切除等DNA损伤修复机制，将5-mC或经化学基团修饰后的5-mC 转化为C. NatureReviewsMolecularCellBiology, 2010, 11(9):607-620；SANCARA,LINDSEYB LA,UNSALKK,etal.MolecularmechanismsofmammalianDNArepairandtheDNA damagecheckpoints.AnnuRevBiochem, 2004,73:39-85]。 大量研究表明，TET蛋白家族可催化5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC)， 5-hmC又被称为第6种碱基，但对这种碱基的分布和重要性一直缺乏详细理解。5-hmC最 初在多种动物的DNA中被发现，且在早期胚胎和神经系统中有大量分布。TET蛋白家族 具有催化5-mC羟基化的酶活性，而5-hmC在染色体上的分布与基因表达具有明显关系.ChemBiol，200916(6):580-583]。后来研究发现，在多种细胞的基因组DNA中都 能检测到TET蛋白进一步将5-hmC氧化，生成5-酰基胞啼陡（5-formylcytosine，5fC) 和5-羧基胞啼卩定（5_。&1'130171。7七08；. Science，2011，333:1300-1303]，它们都被认为是去甲基化过程的中间产物，是哺乳动物中 重要的DNA表观遗传标记。 已有研究表明，表观修饰在肿瘤发生和发展过程中均发挥重要的作用，而多项实 验发现，TET蛋白基因突变或结构异常与造血系统恶性肿瘤密切相关.CellCycle, 2009,8(24) :4044-4048]。2009 年 3 月，TefferiA等人首先发现，在大约 14% 的JAK2V617F 阳性MPNs患者中存在TET2突变，且这些突变存在于早期造血干细胞（⑶34+⑶38-)中，这 一重要发现使得TET2成为最近血液肿瘤领域的研究热点。随后的大量研究发现，其他髓 系恶性肿瘤，如慢性骨髓单核细胞性白血病（chronicmyelomonocyticleukemia，CMML)、 骨髓增生异常综合症（myelodysplasticsyndrome，MDS)、急性髓细胞性白血病（Acute MyelocyticLeukemia，AML)和M7AML等患者体内也存在TET蛋白突变体。有研究发现，在 多个AML患者中鉴定出存在TET1与组蛋白甲基转移酶MLL基因融合的现象.Leukemia， 2003,17(3) :637-641 ]。TET2 在骨髓增生性肿瘤（myeloproliferativeneoplasms，MPN) 中突变率为 7. 6%，CMML中为 42%，AML中为 12% .Blood，2009，114(l):144-147]。TET2 是至今鉴定出的突变最频繁的 MDS相关基因.NatGenet,2009,41(7):838-842], 在大约20%的MDS患者中鉴定出TET2基因突变，且与临床症状密切相关，因此可作为一种 良好的诊断分子标志物.Blood，2009，114(15):3285-3291]〇 TET2全称为TET癌基因家族成员2(TEToncogenefamilymember2)，其基因位 于染色体4q24上，含11个外显子，mRNA有三种选择性剪切体，在体内广泛表达。TET2蛋 白共有三种亚型分别为亚型1、2、3,其中全长2002个氨基酸的TET2蛋白亚型1包含两个 进化高度保守区域。在脊椎动物中存在三种保守的了￡1'蛋白4￡1'1、了￡了2、了￡了3，了￡1'1在胚 胎干细胞（EScells)、TET2在造血细胞中、TET3在卵母细胞和受精卵中大量表达。TET蛋 白涉及到多种生物进程，如早期胚胎形成、干细胞分化和造血作用.Nat. Rev.Genet. , 2011, 13: 7-13 ；H.Wu,Y.Zhang. ,MechanismsandfunctionsofTetprot ein-mediated5-methylcytosineoxidation.Genes&Dev.，2011，25:2436-2452]〇 TET蛋白属于a-酮戊二酸（alpha-ketoglutaricacid,a-KG)和Fe2+依赖的双加氧 酶，在靠近C端的位置有1个催化结构域（catalytic/dioxygenasedomain),该结构域 具有3个金属离子（Fe2+)和1个a-KG的结合位点，催化结构域前还有一段富含半胱氨 酸的区域（Cys-richdomain)。TET蛋白的催化机制为：氧和a-KG在为5-mC提供羟基 的同时a-KG氧化脱羧生成琥拍酸，该过程还需要Fe2+和抗坏血酸的参与.Cance当前第1页1 2 3 4 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多肽，选自：（1）SEQ ID NO:2的至少截去了第1490‑1830位氨基酸残基的截短片段，其中，所述截短片段的氨基酸序列如下式所示：X－L－Y式中，X表示至少含有SEQ ID NO:2第1129‑1448位氨基酸残基的SEQ ID NO:2的片段；Y表示至少含有SEQ ID NO:2第1844‑1925位氨基酸残基的SEQ ID NO:2的片段；L表示接头序列；和（2）在（1）所述的多肽序列中存在一个或数个氨基酸插入、取代或删除，但仍保留DNA羟甲基化酶活性的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐彦辉，胡璐璐，李泽，程净东，巩微，饶钦辉，刘梦杰，朱佳玉，王平，
申请(专利权)人：徐彦辉，
类型：发明
国别省市：上海;31
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