CAR酶及脂肪醇的改良生产制造技术

本发明专利技术公开涉及用于在重组宿主细胞中改良生产脂肪醇的变体羧酸还原酶(CAR)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2012年4月2日提交的美国临时申请号61/619,309的权益，该申请以饮用方式并入本文。序列表本专利技术包括序列表，该序列表通过EFS-Web以ASCII形式提交，并且全文以引用方式并入本文。在2013年4月2日创建的所述的ASCII拷贝命名为LS00039PCT_SL.txt，并且大小为89,038字节。
本专利技术公开涉及在重组宿主细胞中改良生产脂肪醇的变体羧酸还原酶(CAR)。本专利技术公开进一步涉及变体CAR核酸和多肽以及重组宿主细胞和细胞培养物。本专利技术公开进一步涵盖了制作脂肪醇组合物的方法。
技术介绍
脂肪醇构成了工业生化制品的重要类别。这些分子及其衍生物具有多种用途，包括表面活性剂、润滑剂、增塑剂、溶剂、乳化剂、软化剂、增稠剂、风味剂、香料和燃料。在工业上，脂肪醇是通过脂肪酸(其由天然来源产生，该天然来源例如椰子油、棕榈油、棕榈坚果油、牛脂和猪油)的催化氢化或者通过α-烯烃(由石油化学品供料产生)的化学水合而生产。由天然来源衍生的脂肪醇具有可变的链长。脂肪醇的链长对于具体应用而言是重要的。实际上，脂肪醇还通过酶制得，其中所述的酶能够将酰基-ACP或酰基-CoA分子还原成相应的伯醇(例如参见美国专利公开号20100105955、20100105963和20110250663，这些文献以引用方式并入本文)。目前用于生产脂肪醇的技术涉及脂肪酸的无机催化剂介导的还原成相应的伯醇，这是昂贵、费时且繁冗的。在这种方法中使用的脂肪酸衍生自天然来源(例如上述植物和动物油、以及脂肪)。此外，还可以通过化学催化来将脂肪醇脱水形成α-烯烃。然而，该技术是不可再生的，并且涉及高的操作成本和具有环境危害的化学废品。因此，需要改良的脂肪醇的生产方法，并且本专利技术公开解决了该需要。专利技术概述本专利技术公开的一个方面提供了包括如下氨基酸序列的变体羧酸还原酶(CAR)多肽，其中所述的氨基酸序列与SEQ ID NO:7具有至少大约90％的序列一致性，其中变体CAR多肽是经过基因改造的，从而在如下氨基酸位置处具有至少一个突变，其中所述的氨基酸位置选自氨基酸位置3、18、20、22、80、87、191、288、473、535、750、827、870、873、926、927、930和1128。因此，变体CAR多肽在重组宿主细胞中的表达得到比表达相应的野生型多肽的重组宿主细胞更高的脂肪醇组合物的效价。在相关的方面中，CAR多肽为CarB多肽。在另一个相关的方面中，变体CAR多肽包括在位置S3R、D18R、D18L、D18T、D18P、E20V、E20S、E20R、S22R、S22N、S22G、L80R、R87G、R87E、V191S、F288R、F288S、F288G、Q473L、Q473W、Q473Y、Q473I、Q473H、A535S、D750A、R827C、R827A、I870L、R873S、V926A、V926E、S927K、S927G、M930K、M930R和/或L1128W中的突变。在相关的方面中，CAR多肽包括：突变A535S；或突变E20R、F288G、Q473I和A535S；或突变E20R、F288G、Q473H、A535S、R827A和S927G；或突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827A和S927G；或突变S3R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930R和L1128W；或E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930R和L1128W；或突变D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G、M930K和L1128W；或突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、S927K和M930R；或突变D18R、E20R、288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、M930K和L1128W；或突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、V926A、S927K和M930R；或突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S和R827C；或突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C和M930R；或突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、I870L、S927G和M930R；或突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、I870L和S927G；或突变D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、V926A和S927G；或突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L和L1128W；或突变D18R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L、S927G和L1128W；或突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927G和L1128W；或突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927G、M930K和L1128W；或突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、I870L、S927G和M930K；或突变E20R、F288G、Q473I、A535S、I870L、M930K；或突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、S927G、M930K和L1128W；或突变D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G和L1128W；或突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、、R827C、I870L和S927G；或突变D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927G和L1128W；或突变D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G、M930R和L1128W；或突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、V926E、S927G和M930R；或突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L、V926A和L1128W；或它们的组合。本专利技术公开的另一个方面提供了包括如下多核苷酸序列的宿主细胞，其中所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包括如下氨基酸序列的变体羧酸还原酶(CAR)多肽，其中所述的氨基酸序列与SEQ ID NO:7具有至少大约90％的序列一致性，其中所述的变体CAR多肽经基因改造，从而在如下氨基酸位置处具有至少一个突变，其中所述的氨基酸位置选自氨基酸位置3、18、20、22、80、87、191、288、473、535、750、827、870、873、926、927、930和1128。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.02 US 61/619,3091.一种包括如下氨基酸序列的变体羧酸还原酶(CAR)多肽，其
中所述的氨基酸序列与SEQ ID NO:7具有至少大约90％的序列一致
性，其中所述的变体CAR多肽经基因改造，从而在如下氨基酸位置
处具有至少一个突变，其中所述的氨基酸位置选自氨基酸位置3、18、
20、22、80、87、191、288、473、535、750、827、870、873、926、
927、930和1128。
2.权利要求1所述的变体CAR多肽，其中与表达相应的野生型
多肽的重组宿主细胞相比，所述的变体CAR多肽在重组宿主细胞中
的表达得到更高的脂肪醇组合物的效价。
3.权利要求1所述的变体CAR多肽，其中所述的CAR多肽为
CarB多肽。
4.权利要求1所述的变体CAR多肽，其中所述的变体CAR多肽
包括选自S3R、D18R、D18L、D18T、D18P、E20V、E20S、E20R、
S22R、S22N、S22G、L80R、R87G、R87E、V191S、F288R、F288S、
F288G、Q473L、Q473W、Q473Y、Q473I、Q473H、A535S、D750A、
R827C、R827A、I870L、R873S、V926A、V926E、S927K、S927G、
M930K、M930R和L1128W的突变。
5.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体CAR多肽
包括突变A535S。
6.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括

\t突变E20R、F288G、Q473I和A535S。
7.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、F288G、Q473H、A535S、R827A和S927G。
8.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827A和S927G。
9.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变S3R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、
M930R和L1128W。
10.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R873S、S927G、M930R
和L1128W。
11.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G、M930K
和L1128W。
12.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、S927K
和M930R。
13.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变D18R、E20R、288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、M930K
和L1128W。
14.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、V926A、S927K
和M930R。
15.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S和R827C。
16.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C和M930R。
17.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、I870L、S927G和M930R。
18.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、I870L和S927G。
19.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、
V926A和S927G。
20.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L和L1128W。
21.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变D18R、E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、R827C、I870L、

\tS927G和L1128W。
22.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927G
和L1128W。
23.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927G、
M930K和L1128W。
24.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F288G、Q473H、A535S、I870L、S927G和M930K。
25.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、F288G、Q473I、A535S、I870L、M930K。
26.权利要求4所述的变体CAR多肽，其中所述的变体多肽包括
突变E20R、S22R、F28...

【专利技术属性】
技术研发人员：德里克·L·格林菲尔德，伊利莎白·J·克拉克，伊莱·S·格罗班，维克朗斯·阿拉盖达，S·李，X·李，Z·胡，B·朱，
申请(专利权)人：REG生命科学有限责任公司，德里克·L·格林菲尔德，伊丽莎白·J·克拉克，伊莱·S·格罗班，维克朗斯·阿拉盖达，S·李，X·李，Z·胡，B·朱，
类型：发明
国别省市：美国;US