一株产乙内酰脲酶系的节杆菌制造技术

本发明专利技术公开了一种乙内酰脲酶系及其编码基因与生产菌。本发明专利技术的目的是提供一种转化效率较高的乙内酰脲酶系及其编码基因。本发明专利技术乙内酰脲酶系的编码基因，具有下列序列之一：１）序列表中序列１的ＤＮＡ序列；２）与序列表中序列１限定的ＤＮＡ序列具有９０％以上同源性，且编码相同蛋白质的ＤＮＡ序列。本发明专利技术的乙内酰脲酶系，由下述３种蛋白质组成：１）具有乙内酰脲消旋酶活性的序列２蛋白质；２）具有乙内酰脲水解酶活性的序列３蛋白质；３）具有Ｎ－氨甲酰氨基酸水解酶活性的序列４蛋白质。本发明专利技术提供的上述乙内酰脲酶系的生产菌是节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）ＢＴ８０１ＣＧＭＣＣ№０７３４。本发明专利技术的乙内酰脲酶系具有生产氨基酸等广泛的实际应用价值。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶系及其编码基因与生产菌，特别是一种乙内酰脲酶系及其编码基因与生产菌。乙内酰脲酶系在动物、植物和微生物中分布广泛，尤其以在微生物种群中分布较为广泛。乙内酰脲酶系的主要应用是进行各种氨基酸的酶法生产，不仅可用于各种天然氨基酸的酶法生产，还可用来生产D-型氨基酸以及各种D-或L-型的非天然氨基酸。一种乙内酰脲酶系的编码基因，它具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同蛋白质的DNA序列。一种乙内酰脲酶系，由下述3种蛋白质组成1)具有序列表中序列2的氨基酸序列的乙内酰脲消旋酶或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有乙内酰脲消旋酶活性的由序列2衍生的蛋白质；2)具有序列表中序列3的氨基酸序列的乙内酰脲水解酶或将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有乙内酰脲水解酶活性的由序列3衍生的蛋白质；3)具有序列表中序列4的氨基酸序列的N-氨甲酰氨基酸水解酶或将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有N-氨甲酰氨基酸水解酶活性的由序列4衍生的蛋白质。本专利技术的另一个目的是提供一种上述乙内酰脲酶系的高效生产菌。本专利技术提供的上述乙内酰脲酶系的生产菌是节杆菌(Arthrobacter sp.)BT801CGMCC No0734及其功能相同的突变体或变异体。节杆菌(Arthrobacter dp.)BT801已于2002年03月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No0734。本专利技术的节杆菌从沈阳市浑河地区污泥中分离得到，为革兰氏染色阳性菌，不抗酸，不分解纤维素，接触酶阳性，于脱脂牛奶中加热至63℃15分钟不存活。菌体在生长过程中经历一个球状—杆状—球状的周期性变化。菌株在GYP或LB平板上生长良好，菌落为圆形且边缘整齐。在暗培养条件下菌落呈乳白色，在光照条件下转为乳黄至深黄色。乙内酰脲酶系产生菌Arthrobacter BT801的染色体DNA，经Sau3A I部分酶切后分离30kb左右的片段，与经Hpa I和Pst I酶切的黏粒载体pKC505进行连接，将连接产物用包装蛋白包装，转染大肠杆菌DH5α，得到转化子。利用薄层层析的方法从转化子中筛选得到阳性克隆，通过亚克隆得到了序列表中序列1的乙内酰脲酶系的完整基因，该基因能利用自身的启动子在大肠杆菌中进行表达产生有活性的序列表中序列2、序列3、序列4的蛋白。本专利技术的乙内酰脲酶系具有广泛的实际应用价值。光学活性氨基酸在医药和食品行业应用非常广泛，氨基酸的酶法生产是目前生产氨基酸的主要手段之一。乙内酰脲酶系能够将5-位单取代乙内酰脲类化合物特异水解为氨基酸。例如，L-色氨酸可作为氨基酸输液的成份和饲料添加剂，市场潜力很大，有关L-色氨酸酶法生产的报道很多，其中利用乙内酰脲酶系以5-吲哚甲基乙内酰脲为生产原料的路线颇受关注。尤其是利用本专利技术的酶系生产苯丙氨酸具有重要的经济实用意义。又如，L-苯丙氨酸是二肽甜味剂天冬甜精的主要原料，在这种甜味剂的生产成本中占相当比重，由5-苄基乙内酰脲酶法生产，方法新颖，前景乐观。此外一些难于发酵生产的脂肪族氨基酸如L-缬氨酸、L-丙氨酸和L-异亮氨酸等亦可望通过本专利技术的乙内酰脲酶系进行酶法生产。本专利技术的乙内酰脲酶具有L-和D-两种不同立体选择性，相应水解产物也可为L-或D-型的手性氨基酸，尤其对于一些不能直接通过发酵生产的D-型氨基酸和非蛋白质氨基酸，乙内酰脲酶更独具优势。利用乙内酰脲酶酶法生产氨基酸的另一个优势还在于，酶促水解过程不仅仅是选择性水解外消旋底物中的一种异构体，而且能够利用乙内酰脲类化合物的消旋作用将其对映体不断转化为可被酶解的那种异构体，因此在理论上乙内酰脲酶酶法生产氨基酸的转化率可达100％，而且消旋作用与酶促水解可以在同一个体系中同时进行，使工艺大大简化。碱性条件可以催化乙内酰脲的消旋，但通常这种化学消旋是一个非常缓慢的过程。例如在室温和pH8.5的条件下，20h只有10％L-吲哚甲基乙内酰脲(L-IMH)转化为D-IMH。而乙内酰脲消旋酶可以在生理条件下高效率地催化乙内酰脲类化合物的消旋，在乙内酰脲酶酶法生产氨基酸中具有重要作用。此外，根据对地球原始环境的推测和分析，原始水圈的氨基酸可能多以对应的N-氨甲酰氨基酸或乙内酰脲类化合物的形式存在。乙内酰脲酶还被认为是在微生物三界系统形成之前就已经存在的一种将N-氨甲酰氨基酸或乙内酰脲转化为游离氨基酸的原始酶类，因此乙内酰脲酶及其产生菌是研究生命起源和进化的重要生物材料。下面结合附图及具体实施例对本专利技术做进一步说明。图2为酶转化产物的红外光谱图。图3为酶解产物的质谱图。2、转化反应及转化产物的分离精制将5g DL-5-苄基乙内酰脲(可以按照水野正.JP.1985，60-11473和段々英则，水野正.JP.1985，60-11457的方法合成)和由上述步骤中100ml培养液得到的BT801菌体与含0.5mmol/L CoC12的PBS混合，于45℃保温搅拌反应24小时，待不溶的底物消失且用Ehrlish试剂检测中间产物显色反应微弱时停止转化反应。将反应混合物于10000r/min离心15min，上清液通过732阳离子交换树脂柱，用蒸馏水洗2次，再用0.2mmol/L NH4OH洗脱，收集紫外吸收强的组分，减压浓缩，调pH至5.48，加2倍乙醇，冷却使结晶。收集析出的结晶，再溶于水，用乙醇重结晶，得到约2g精制产物。3、转化产物的鉴定对该酶转化产物进行了薄层层析、熔点、元素分析、旋光等理化分析及紫外、红外和质谱等光谱学分析，结果如表1、附图说明图1、图2及图3所示。表1酶转化产物物理常数的测定结果转化产物 标准品薄层层析Rf0.65 0.65比旋光度20D-34.2-34.5熔点℃ 235 237元素分析CHN 65.366.798.3165.456.668.48图1中，A为L-苯丙氨酸标准品(日本味之素公司产品)；B为转化产物；所用仪器为Shimadzu UV-2201，样品浓度为0.82mg/ml。图2中，曲线A为L-苯丙氨酸标准品(日本味之素公司产品)；曲线B为转化产物。图3中，A为L-苯丙氨酸标准品(日本味之素公司产品)；B为转化产物；轰击电子能量为70ev，加速电压为6KV。从表1及图1-3中的结果可以看出BT801转化DL-5-苄基乙内酰脲所得产物确为L-苯丙氨酸。序列表<160>4<210>1<211>4261<212>DNA<213>人工序列<400>1gatctacacc tattgggcag gattcaactg gccggcactc ggcgtgtatg tcgccgcgct60gctgttgtcc ctgctcacgc ccgatctcat gtttgtcaca ggtctcgttg catccggaat120tctgcattat ctagt本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙内酰脲酶系的编码基因，它具有下列序列之一： １）序列表中序列１的ＤＮＡ序列； ２）与序列表中序列１限定的ＤＮＡ序列具有９０％以上同源性，且编码相同蛋白质的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张惟材，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]