本发明专利技术公开了酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的高效表达纯化方法。本发明专利技术方法是将酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的编码序列通过原核表达质粒pTWIN1转入到大肠杆菌中，构建得到的重组大肠杆菌可以通过IPTG诱导表达可溶性融合蛋白CBD-intrin1-MT。该融合蛋白中的CBD结构与能与几丁质柱结合，内含肽与金属硫蛋白成熟肽连接处发生自剪切作用，获得游离的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。本发明专利技术方法生产的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽与酿酒酵母的天然产物具有完全相同的氨基酸结构，安全可靠，具有清除自由基和吸附重金属的能力，在医药、食品、化妆品或重金属污染治理等领域有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种可高效表达、纯化酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的方法。
技术介绍
金属硫蛋白(Metallothionein, MT)是一类低分子量、高半胱氨酸含量(约占氨基酸总量的30%)、不含芳香族氨基酸的小分子金属结合蛋白。它广泛存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌、细菌等中。1957年，Margoshes和Vallee在研究镉的生物学作用时，首次从马肾中发现含镉MT。迄今大量研究表明，MT能被多种因素诱导产生，在吸附重金属离子、调节微量元素（如Zn、Cu）代谢、清除自由基、拮抗电离辐射等方面发挥着十分重要的作用。同时，MT的产生还与老年性痴呆症、Wilson病、肿瘤发生发展等密切相关。因此，对MT的理论和实际应用研究具有广阔的前景。酿酒酵母（S.cescerevisiae）金属硫蛋白由61个氨基酸残基组成，相对分子质量为5700，在N端有一段由8个氨基酸组成的信号肽。酿酒酵母金属硫蛋白在体内经过加工去掉N端的信号肽，成为成熟肽后，才具有清除自由基、吸附重金属等生理功能。酿酒酵母MT与人体MT结构相近，且酵母MT对自由基的清除能力比动物组织的MT更强。许多学者通过金属离子诱导的方法从酿酒酵母中获得MT，但产量不高，无法很好的应用于工业生产。运用基因工程技术可以帮助人们获得高产量的目的蛋白，要获得具有生理活性的MT需要解决在工程菌中切除N端信号肽，简化产物纯化步骤等问题。目前关于使用基因工程技术在工程菌中高效表达酿酒酵母MT的报道很少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有的酿酒酵母金属硫蛋白的成熟肽产量不高，需要解决切除信号肽、简化产物纯化步骤等问题，提供一种简单高效的表达纯化酿酒酵母金属硫蛋白的成熟肽的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现：本专利技术的技术思路是利用原核表达质粒pTWIN1便捷的产物纯化方法，将目的基因与pTWIN1载体相连，构建重组质粒后转入工程菌中，表达得到的融合蛋白中含有能与几丁质高效结合的CBD结构域，和能够在特定温度和pH条件下发生自剪切作用的内含肽intein。将融合蛋白经几丁质柱高效亲和纯化，并经特定温度和pH诱导后发生独特的在柱自剪切作用，洗脱后即可获得纯化的目的蛋白。本专利技术酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法包括如下步骤：（1）根据酿酒酵母S.cescerevisiae基因组序列，设计扩增金属硫蛋白成熟肽编码序列的上、下游引物，序列如SEQ ID NO:1~2所示；（2）以酿酒酵母菌株的基因组为模板，用步骤（1）所述引物进行PCR扩增；（3）将步骤（2）PCR扩增所得的产物连接到质粒pTWIN1上，构建重组质粒，转化感受态-->大肠杆菌ER2566，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌；（4）培养重组大肠杆菌至OD600值达到0.6时，加入IPTG诱导融合蛋白表达，收集菌液，离心、取上清，得到以可溶形式表达的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白；（5）将步骤（4）得到的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白过几丁质柱进行亲和纯化，洗脱后进行自切割反应，反应完毕后洗脱收集，得到酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。作为一种优选方案，上述方法中，步骤（2）中，所述PCR扩增的反应条件为：95℃ 3min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s和72℃ 10min，其中，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s循环26次。作为一种优选方案，上述方法中，步骤（5）中，所述自切割反应前/后的洗脱所用的缓冲液配方为20mmol/L的Na-HEPES、0.5mol/L的NaCl和1mmol/L的EDTA；更进一步地，所述缓冲液体积为20ml，pH为7.0。作为一种优选方案，上述方法中，步骤（5）中，所述自切割反应的温度为25℃，反应时间为25h。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：酿酒酵母金属硫蛋白在体内需要经过加工去掉信号肽，成为成熟肽后，才具有清除自由基、吸附重金属等生理功能。要获得具有生理活性的MT需要解决在工程菌中切除N端信号肽，简化产物纯化步骤等问题。本专利技术直接表达酿酒酵母金属硫蛋白的成熟肽，无需在工程菌中切除金属硫蛋白N端的信号肽，表达产物已具有清除自由基、吸附重金属等生理功能。目前关于使用基因工程技术在工程菌中高效表达酿酒酵母MT的报道很少，且表达的MT蛋白通常带有蛋白纯化所需要的标签，如His标签、SUMO标签、GST标签等。在融合蛋白纯化之后，需要用特定的蛋白酶将标签切除，才能获得有活性的MT蛋白，而目前常用的蛋白酶普遍存在成本高昂、标签切割的特异性不强等缺点。本专利技术采用pTWIN1载体表达CBD-intein1-MT融合蛋白，能利用内含肽的自剪切功能，一步达到将标签切除，同时获得高纯度MT蛋白的目的。本专利技术无需使用特定的蛋白酶，降低了纯化的成本；同时，避免了蛋白酶切割所带来的非特异性酶解，也无需进一步纯化以去除蛋白酶。因此本专利技术具有简化MT蛋白的纯化步骤、显著降低成本等优点。附图说明图1为重组大肠杆菌融合蛋白表达情况的SDS-PAGE电泳分析，其中，M为蛋白Marker，1为诱导6 h的重组菌，2为未诱导的重组菌，3为诱导6 h的转有空载的重组菌，4为未诱导的非重组菌；图2为重组大肠杆菌融合蛋白表达情况的Western印迹检测，其中，M为蛋白Marker，1为诱导6 h的重组菌，2为未诱导的重组菌，3为诱导6 h的转有空载的重组菌，4为未诱导的非重组菌；图3为用于检测融合蛋白可溶性的SDS-PAGE电泳分析，其中，M为蛋白Marker，1为重组菌破壁后上清，2为重组菌破壁后沉淀；图4为纯化后的金属硫蛋白成熟肽的SDS-PAGE电泳分析，其中，M为蛋白Marker，1为纯化后的MT；-->图5为重组大肠杆菌对铜离子的耐受能力检测，其中，a为重组大肠杆菌，b为未转入重组质粒的大肠杆菌，培养基中CuSO4浓度为3.8 mmol/L。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。实施例1 酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化1. 编码序列的扩增引物设计根据NCBI提供的酿酒酵母（S.cescerevisiae）基因组序列，设计扩增金属硫蛋白成熟肽编码序列的上下游引物序列如SEQ ID NO:1~2所示。酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽编码序列的扩增以酿酒酵母AS2.489菌株（购自中科院微生物所菌种保藏中心）的基因组为模板，用实施例1得到的金属硫蛋白成熟肽编码序列的特异性扩增引物，进行PCR扩增。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s和72 ℃ 10 min，其中，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循环26次。重组大肠杆菌的构建（1）将实施例2得到的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽编码序列的PCR扩增产物与质粒pMD18-T连接，转化感受态大肠杆菌JM109，选取阳性克隆抽提质粒后进行BspQⅠ、PstⅠ双酶切鉴定和测序鉴定确保序列的正确性。（2）对测序正确的质粒pMD18-T-MT进行BspQⅠ、PstⅠ双酶切，回收酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽编码序列片段，连接到同样双酶切过的质粒pTWIN1上，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌ER本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于包括如下步骤：（１）根据酿酒酵母Ｓ．ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ基因组序列，设计扩增金属硫蛋白成熟肽编码序列的上、下游引物，序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～２所示；（２）以酿酒酵母菌株的基因组为模板，用步骤（１）所述引物进行ＰＣＲ扩增；（３）将步骤（２）ＰＣＲ扩增所得的产物连接到质粒ｐＴＷＩＮ１上，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌ＥＲ２５６６，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌；（４）培养重组大肠杆菌至ＯＤ６００值达到０．６时，加入ＩＰＴＧ诱导融合蛋白表达，收集菌液，离心、取上清，得到以可溶形式表达的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白；（５）将步骤（４）得到的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白过几丁质柱进行亲和纯化，洗脱后进行自切割反应，反应完毕后洗脱收集，得到酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。
【技术特征摘要】
1.酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于包括如下步骤：（1）根据酿酒酵母S.cescerevisiae基因组序列，设计扩增金属硫蛋白成熟肽编码序列的上、下游引物，序列如SEQ ID NO:1~2所示；（2）以酿酒酵母菌株的基因组为模板，用步骤（1）所述引物进行PCR扩增；（3）将步骤（2）PCR扩增所得的产物连接到质粒pTWIN1上，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌ER2566，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌；（4）培养重组大肠杆菌至OD600值达到0.6时，加入IPTG诱导融合蛋白表达，收集菌液，离心、取上清，得到以可溶形式表达的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白；（5）将步骤（4）得到的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白过几丁质柱进行亲和纯化，洗脱后进行自切割反应，反应完毕后洗脱收集，得到酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘泽寰，梁晓峰，龚映雪，肖文娟，李晶博，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81
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