一种P450BM3突变体及其在以苯或苯酚为底物合成对苯二酚中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种与细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著关联的突变位点，细胞色素P450BM3单加氧酶突变体及其编码基因，含有P450BM3单加氧酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化子、该突变体的制备方法，以及该突变体在以苯或苯酚为底物合成对苯二酚中的应用。与野生型细胞色素P450BM3单加氧酶相比，本发明专利技术的P450BM3突变体表现出了高活性和优异的区域选择性，使用该突变体能够更好地制备纯的对苯二酚，同时能大幅度降低生产成本，从而更好地用于对苯二酚的工业化生产中。

A P450BM3 Mutant and Its Application in the Synthesis of Hydroquinone with Benzene or Phenol as Substrate

The invention provides a mutant site significantly associated with specific enzyme activity of cytochrome P450BM3 monooxygenase, a mutant of cytochrome P450BM3 monooxygenase and its coding gene, a recombinant expression vector and a recombinant expression transformer containing the mutant gene of P450BM3 monooxygenase, a method for preparing the mutant, and a method for synthesizing hydroquinone with benzene or phenol as a substrate. Application. Compared with the wild type cytochrome P450BM3 monooxygenase, the mutant P450BM3 of the present invention exhibits high activity and excellent regioselectivity. Using the mutant, the pure hydroquinone can be prepared better, and the production cost can be greatly reduced, so that it can be better used in the industrial production of hydroquinone.

【技术实现步骤摘要】
一种P450BM3突变体及其在以苯或苯酚为底物合成对苯二酚中的应用
本专利技术属于生物工程
，具体而言，涉及一种与细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著关联的突变位点，细胞色素P450BM3单加氧酶突变体及其编码基因，含有P450BM3单加氧酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化子、该突变体的制备方法，以及该突变体在以苯或苯酚为底物合成对苯二酚中的应用。
技术介绍
对苯二酚(Hydroquinone；HQ)是化学和制药领域中的重要中间体。它可被用作照相的显影剂、橡胶和汽油的抗氧化剂，是制造染料和医药化合物的原料，以及制备生物活性天然产物和功能性材料如聚合物液晶和其他聚合物的基本原料。对苯二酚也是一种天然产物，以信息素的形式存在于白蚁中，同时以被称为熊果苷的单糖基化形式存在于各种高等植物中。目前，化学催化对苯二酚合成的最原始途径是通过苯胺的氧化，苯胺被MnO2在H2SO4水溶液中氧化形成苯醌，然后通过Fe0或氢化作用还原苯醌，最后得到产物氢醌。虽然目前全球约10％的对苯二酚仍然采用这种方式生产，但是Krumenacker,L等(InKirkOthmerEncyclopedi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著关联的突变位点，其特征在于，该突变位点位于野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的如下氨基酸处：(1)第78位缬氨酸处；或(2)第82位丙氨酸处；或(3)第328位丙氨酸处；或(4)第78位缬氨酸和第82位丙氨酸处；或(5)第78位缬氨酸和第328位丙氨酸处；或(6)第82位丙氨酸和第328位丙氨酸处；或(7)第78位缬氨酸、第82位丙氨酸和第328位丙氨酸处；将所述突变位点的氨基酸突变为苯丙氨酸后，细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著提高。

【技术特征摘要】
1.一种与细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著关联的突变位点，其特征在于，该突变位点位于野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的如下氨基酸处：(1)第78位缬氨酸处；或(2)第82位丙氨酸处；或(3)第328位丙氨酸处；或(4)第78位缬氨酸和第82位丙氨酸处；或(5)第78位缬氨酸和第328位丙氨酸处；或(6)第82位丙氨酸和第328位丙氨酸处；或(7)第78位缬氨酸、第82位丙氨酸和第328位丙氨酸处；将所述突变位点的氨基酸突变为苯丙氨酸后，细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活显著提高。2.如权利要求1所述的突变位点在提高细胞色素P450BM3单加氧酶的比酶活及催化选择性中的应用，所述的比酶活是细胞色素P450BM3单加氧酶催化苯一锅法合成对苯二酚的活性或/和以苯酚为底物合成对苯二酚的活性，所述的催化选择性是底物苯或苯酚的对位选择性羟基化。3.一种比酶活提高的细胞色素P450BM3单加氧酶突变体，其特征在于，所述突变体选自如下任一种：(1)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第78位的缬氨酸残基突变为苯丙氨酸，所得突变体命名为P450V78F；(2)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第82位的丙氨酸残基突变为苯丙氨酸，所得突变体命名为P450A82F；(3)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第328位的丙氨酸残基突变为苯丙氨酸，所得突变体命名为P450A328F；(4)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第78位的缬氨酸残基和第82位的丙氨酸残基同时突变为苯丙氨酸，所得突变体命名为P450V78F/A82F；(5)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的第78位的缬氨酸残基和第328位的丙氨酸残基同时突变为苯丙氨酸，所得突变体命名为P450V78F/A328F；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李爱涛，周航宇，余小娟，王斐，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42