一种monellin蛋白突变体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种monellin蛋白突变体及其制备方法。本发明专利技术对单链monellin进行了定点突变，得到一种热稳定性突变体，并在毕赤酵母中成功表达，解决了甜味蛋白在生产运输中易降解的技术难题；同时增加了蛋白甜度，使得在其少量情况下就就能达到良好的甜味效果，为该甜味蛋白大规模工业化市场化打下坚实基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白突变体
，特别是涉及一种monellin蛋白突变体及其制备方法。
技术介绍
甜味蛋白monellin是西非植物Dioscoreophyllumcumminsii中提取的一种天然甜味剂，具有强烈的甜味，甜度在相同条件下约为相同质量蔗糖的3000倍，天然的monellin蛋白是由两条不同的肽链通过共价键结合在一起，由A链和B链组合而成，研究发现天然的monellin蛋白在高温下易失去活性，1989年Kim等人通过基因工程方法将两条肽链结合成一条蛋白链，使其热稳定性得到大大提升，在宽范围PH下保持稳定，同时其甜度未发生太大变化。由于本身不含糖分，可以作为糖尿病人和心血管病人的最好甜味替代食品，也可以有效的预防儿童龋齿的发生，具有非常大的市场潜力。单链monellin蛋白在65℃下处理就会失去活性，使其在生产和运输过程中受到了限制。单链monellin蛋白采用基因工程手段也在其他生物中表达成功，如大肠杆菌表达系统、植物表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、但是由于这些表达系统产量和有毒代谢物质的问题使得monellin蛋白无法大规模发酵生产。采用甲醇诱导毕赤酵母发酵使得monellin蛋白产量得到很大提升，但是由于有毒物质甲醇的加入，发酵产品安全问题成为隐患。另外如何将目的蛋白直接分泌到胞外，节省后期纯化成本，且在发酵过程中不添加诱导剂，减少发酵过程中的染菌概率，另外还要避免有毒代谢物质，保证了该蛋白作为食r>品添加剂的安全，是本专利技术需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种monellin蛋白突变体及其制备方法。本专利技术对单链monellin进行了定点突变，得到一种热稳定性突变体，并在毕赤酵母中成功表达，解决了甜味蛋白在生产运输中易降解的技术难题；同时增加了蛋白甜度，使得在其少量情况下就就能达到良好的甜味效果，为该甜味蛋白大规模工业化市场化打下坚实基础。采用PGAPZαA质粒可以将目的蛋白直接分泌到胞外，节省了后期纯化成本，由于本身为GADPH自诱导型启动子，发酵过程中不需要添加任何诱导剂，减少了发酵过程中的染菌概率，同时没有任何有毒代谢物质，保证了该蛋白作为食品添加剂的安全。本专利技术的一种monellin蛋白突变体及其制备方法技术方案为，一种monellin蛋白突变体，将野生型单链monellin基因第2位氨基酸谷氨酸(Glu)定点突变为天冬酰胺(Asn)。甜度相对于野生单链monellin蛋白提升3倍。热稳定性相对于野生单链monellin蛋白提升10℃。所述的一种monellin蛋白突变体的制备方法，包括以下步骤：(1)构建野生型单链monellin蛋白表达载体；(2)将步骤(1)中进行定点突变得到突变基因，挑取阳性转化子测序验证；(3)将步骤(2)中测序正确的质粒转化入毕赤酵母中，筛选出成功转化的毕赤酵母；(4)在YPD培养基中诱导表达蛋白，时间为3天；(5)将步骤(4)中表达的蛋白纯化。步骤(1)为，构建含有野生型单链monellin蛋白基因的表达质粒PGAPZαA。步骤(2)突变位点特异性引物：上游P1：[5’-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTAACTGGGAG-3’]；下游P2：[5’-TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3’]。步骤(2)中，用Xhol和NotI内切酶消化PCR产物并与酶切后的PGAPZαA空载体连接，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含25μg/mlZeocin的LLB固体培养基上，过夜培养挑取阳性单菌落并提取质粒，测序验证突变结果，构建突变质粒PGAPZαA-E2N将正确的突变质粒保存备用。步骤(3)中所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115。本专利技术的一种monellin蛋白突变体及其制备方法有益效果为：本专利技术对单链monellin进行了定点突变，得到一种热稳定性突变体，并在毕赤酵母中成功表达，解决了甜味蛋白在生产运输中易降解的技术难题；同时增加了蛋白甜度，使得在其少量情况下就就能达到良好的甜味效果，为该甜味蛋白大规模工业化市场化打下坚实基础。采用PGAPZαA质粒可以将目的蛋白直接分泌到胞外，节省了后期纯化成本，由于本身为GADPH自诱导型启动子，发酵过程中不需要添加任何诱导剂，减少了发酵过程中的染菌概率，同时没有任何有毒代谢物质，保证了该蛋白作为食品添加剂的安全。附图说明图1是不同温度不同时间下热处理蛋白电泳图。图中，M.-Marker，1-未热处理的蛋白，2-65℃热处理4h，3-65℃下热处理6h，4-75℃热处理6h，5-70℃热处理8h，6-70℃热处理6h，7-80℃热处理2h。具体实施方式：为了更好地理解本专利技术，下面用具体实例来详细说明本专利技术的技术方案。实施例1单链monellin突变基因蛋白的制备(1)野生型单链monellin蛋白载体的构建由中美泰和生物技术有限公司合成野生型单链monellin全基因并在两端分别引物XhoI和NotI两个限制性内切酶位点，经过酶切目的基因片段和PGAPZαA空质粒，用T4DNA连接酶37℃连接过夜，转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞中涂布于含25μg/mlZeocin的LLB固体培养基上，过夜培养挑取阳性转化子，用质粒提取试剂盒提取质粒测序验证，成功构建野生型monellin蛋白载体PGAPZαA-SCM。(2)对野生型单链monellin蛋白定点突变用XhoI和NotI两种限制性内切酶将目的基因片段切下，反映体系如下：将酶切体系在37℃酶切6h，酶切后用2％琼脂糖凝胶电泳分离目的基因和质粒载体，采用胶回收试剂盒纯化目的DNA片段；针对突变位点设计一对特异性引物：上游P1：[5’-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTAACTGGGAG-3’]；下游P2：[5’-TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3’]；上游引入XhoI位点，下游引入NotI位点，根据以下体系进行PCR反应：上述PCR反应按照如下程序进行：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min。PCR结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物用XhoI和NotI两种限制性内切酶处理6h后和胶回收的开环质粒载体用T4DNA连接酶37℃下连接过夜，具体反应体系如下：将连接体系转化入大肠杆菌DH5α感受态细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种monellin蛋白突变体，其特征在于，将野生型单链monellin基因第2位氨基酸谷氨酸(Glu)定点突变为天冬酰胺(Asn)。

【技术特征摘要】
1.一种monellin蛋白突变体，其特征在于，将野生型单链monellin基因第2位氨基酸谷
氨酸(Glu)定点突变为天冬酰胺(Asn)。
2.根据权利要求1所述的一种monellin蛋白突变体，其特征在于，甜度相对于野生单链
monellin蛋白提升3倍。
3.如权利要求1所述利用定点突变方法得到的突变蛋白其特征在于：热稳定性相对于
野生单链monellin蛋白提升10℃。
4.如权利要求1所述的一种monellin蛋白突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步
骤：
(1)构建野生型单链monellin蛋白表达载体；
(2)将步骤(1)中进行定点突变得到突变基因，挑取阳性转化子测序验证；
(3)将步骤(2)中测序正确的质粒转化入毕赤酵母中，筛选出成功转化的毕赤酵母；
(4)在YPD培养基中诱导表达蛋白，时间为3天；
(5)将步骤(4)中表达的蛋白纯化。
5.根据权利要求4所述的一种monellin蛋白突变体的制备方法，其特征在于，步骤(1)
为，构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘波，蔡成固，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37