本发明专利技术公开了出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1及其应用，出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码区序列如SEQ ID NO.4所示，基因组序列如SEQ ID NO.3所示；通过敲除和过表达出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1发现，敲除后出芽短梗霉的生物量及代谢产物聚苹果酸均降低，而过表达后聚苹果酸产量得到提高，证明了出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1参与调控聚苹果酸的合成，因此氮响应转录因子Gat1可用于提高出芽短梗霉的聚苹果酸产量，对进一步提高出芽短梗霉聚苹果产量具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1，还涉及出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1在提高聚苹果酸产量中的应用。
技术介绍
聚苹果酸(Polymalicacid，PMA)是一种新型的可完全生物降解的聚酯型聚合物，由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可用于生物医学材料、营养强化剂、食品包装等领域，具有广泛的应用前景。此外，聚苹果酸的单体为L-苹果酸，是一种优良的食品酸化剂，市场年需求在10万吨以上。聚苹果酸主要由出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)代谢产生，研究发现发酵过程氮源对聚苹果酸合成及细胞生长具有显著影响，且在氮限制条件下有利于聚苹果酸合成，但是对于该机制并不十分清楚，如氮响应转录因子Gat1是否参与调控聚苹果酸合成尚未报道。因此，有必要对氮响应转录因子Gat1进行研究，探究氮源对聚苹果酸合成影响的原因，以进一步提高聚苹果酸的产量。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1；本专利技术的目的之二在于提供含有编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因的过表达载体；本专利技术的目的之三在于提供出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用；本发明的目的之四在于提供含有编码所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因的过表达载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；编码区的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；基因组序列如SEQIDNO.3所示。2、含有编码所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因的过表达载体。优选的，所述过表达载体由以下方法构建：扩增编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1的基因组序列，然后连入过表达载体pBARGPEI的构巢曲霉gpdA强启动子与trpC终止子之间，然后扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1和trpC终止子的表达框，连入pk2-bar-gus的EcoRI酶切位点处，得过表达载体。优选的，扩增编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1的基因组序列的引物如SEQIDNO.26和SEQIDNO.27所示；扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1和trpC终止子的表达框的引物如SEQIDNO.28和SEQIDNO.29所示。3、所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。4、所述含有编码所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因的过表达载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术成功获得了出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因，并获得了该基因的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，编码区序列如SEQIDNO.4所示，基因组序列如SEQIDNO.3所示；对基因功能研究发现，敲除出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因后出芽短梗霉的生物量降低，同时聚苹果酸产量也降低；而过表达出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1后聚苹果酸产量明显提高，约为10-30％，对进一步提高聚苹果酸产量具有重要意义，同时对提高出芽短梗霉其他代谢产物如普鲁兰多糖等的发酵产量也具有指导意义。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：图1为pk2-gus和pk2-Ptrpc-hyg-Ttrpc载体图谱(A：pk2-gus；B：pk2-Ptrpc-hyg-Ttrpc)。图2为出芽短梗霉敲除转化子的PCR引物设计原理图及验证结果。图3为pBARGPEI和pk2-bar-gus的载体结构图(A：pBARGPEI载体结构图；B：pk2-bar-gus载体结构图)。图4为出芽短梗霉Gat1过表达菌株的PCR验证。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、克隆出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因根据出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)全基因组测序结果，利用生物信息学软件设计氮响应转录因子Gat1基因组扩增引物，上游引物为Gat1-F：5’-atgacatcgccgcgcacc-3’(SEQIDNO.1)；下游引物：5’-ttacaaactcatggtaagccattccc-3’(SEQIDNO.2)，然后以出芽短梗霉(A.pullulansCCTCCM2012223)基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃后延伸10min；25℃保温10min。然后将PCR产物经琼脂糖电泳，并回收目的片段，回收产物连接pMD19-TVector，经测序获得如SEQIDNO.3所示序列，其开放阅读框序列如SEQIDNO.4所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。实施例2、出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因敲出(1)出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因敲除载体的构建利用同源重组的方法，以潮霉素抗性标记hyg替换掉氮响应转录因子Gat1中1074bp的一段序列，包括从ATG开始的894bp和ATG上游的180bp，以破坏其表达。具体是以出芽短梗霉(A.pullulansCCTCCM2012223)基因组为模板，使用phataMaxSuper-FidelityDNApolymerse高保真Taq酶，以5arm-F：5’-agtggatcccccggggaattcccatactgtcccatttctcg-3’(SEQIDNO.6)；5arm-R：5’-cagtaggttagctggggttgc-3’(SEQIDNO.7)扩增上游同源臂5arm，同时以3arm-F：5’-gtttagaggtaatccttcttcaaacgacgtgccgactgc-3’(SEQIDNO.8)；3arm-R：5’-acagctatgacatgattacggcaaccattcgtgtaggagcag-3’(SEQIDNO.9)为引物扩增下游同源臂3arm；获得的上游同源臂5arm如SEQIDNO.10所示，下游同源臂3arm如SEQIDNO.11所示。再以pk2-Ptrpc-hyg-Ttrpc载体为模板(图1中B)(参见文献“涂光伟，王永康，冯俊，李晓本文档来自技高网...
【技术保护点】
出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
【技术特征摘要】
1.出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。
2.根据权利要求1所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1，其特征在于：其编码区的核苷酸
序列如SEQIDNO.4所示。
3.根据权利要求1所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1，其特征在于：其基因组序列如SEQ
IDNO.3所示。
4.含有编码权利要求1～3任一项所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1基因组序列的过表达
载体。
5.根据权利要求4所述的过表达载体，其特征在于：所述过表达载体由以下方法构建：扩
增编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1的基因组序列，然后连入过表达载体pBARGPEI
的构巢曲霉gpdA强启动子与trpC终止子之间，然后扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出
【专利技术属性】
技术研发人员：邹祥，王永康，宋晓丹，李正华，李云政，
申请(专利权)人：西南大学，安徽雪郎生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。