一种麦芽糖淀粉酶的突变体及其制备方法技术

一种麦芽糖淀粉酶的突变体及其制备方法，属于基因工程和酶工程领域。是将嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)来源的麦芽糖淀粉酶转苷活性中心的氨基酸残基的取代，与其亲代的麦芽糖淀粉酶相比，其对麦芽糖具有更高的转化效率以及更少的转化副产物。所述B.stearothermophilus麦芽糖淀粉酶突变体，至少以下性质之一发生改变：1)生产周期缩短；2)产物比例提高。这些突变体比野生型麦芽糖淀粉酶更适合用于麦芽糖生产过程。

【技术实现步骤摘要】
一种麦芽糖淀粉酶的突变体及其制备方法
本专利技术涉及一种麦芽糖淀粉酶的突变体及其制备方法，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
麦芽糖是由两个葡萄糖单位经α-1，4糖苷键连接组成的还原性二糖，化学名称是4-O-D-六环葡萄糖基-D-六环葡萄糖。其甜度柔和，又因低粘度、低吸湿性及良好的热稳定性特点，可作为食品增甜剂取代葡萄糖和蔗糖，在食品工业领域具有巨大的应用潜力。工业上麦芽糖的制备，是以淀粉质为原料，经过α-淀粉酶，麦芽(或β-淀粉酶，真菌淀粉酶)水解工艺，制得一种以麦芽糖为主(40％-60％)的糖浆，若麦芽糖含量超过45％(最好在50％以上)，则被称为高麦芽糖浆。在食品工业中高麦芽糖浆的用途之一是制作糕点、糖果等产品。糖浆熬煮温度远高于饴糖，一般超过140℃。麦芽糖含量大于70％，甚至高达90％以上，则被称为超高麦芽糖浆。麦芽糖相比葡萄糖可避免血糖升高，对于应用于抗体、疫苗等的制备具有优于葡萄糖的应用优势。因此超高纯度的麦芽糖浆在医药领域的应用也引起了越来越多的关注。当前麦芽糖生产工艺已较为成熟，使用α-淀粉酶和β-淀粉酶生产麦芽糖时，产物中麦芽糖含量可高达90％，葡萄糖、三糖、四糖以及部分低聚糖和糊精是主要的转化副产物。其中糊精和部分低聚糖，可通过乙醇沉淀去除。超高纯度麦芽糖的制备，则要通过色谱分离和结晶等方法获得。由于麦芽糖黏度大、难结晶，通常要求结晶原料中麦芽糖纯度在90％以上，因此色谱分离的纯度，对麦芽糖结晶起着至关重要的作用。色谱分离基本可去除葡萄糖和五糖及以上的小分子糖类，对麦芽糖纯度影响较小。但产物中的三糖和四糖由于与麦芽糖性质较为相近，往往成为分离纯化中的主要杂质，不仅直接降低了产品纯度，还给麦芽糖结晶性、糖浆粘度以及最终产品的水分含量带来很大不利影响，使麦芽糖最终收率大大降低。麦芽糖淀粉酶具有小分子糖水解活性，可水解三糖、四糖等小分子糖，形成葡萄糖和麦芽糖，因此在超高麦芽糖生产中通常与α-淀粉酶、β-淀粉酶和普鲁兰酶等复配使用以降低副产物比例，使麦芽糖更利于结晶。据报道，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶具有较高的最适反应温度和较低的最适pH反应条件，可满足较为苛刻的工业生产条件，将产物中麦芽糖比例提高至92％，在工业上有极大的应用优势。但专利技术人在前期应用中发现，由于该酶同时具有的水解活性和转苷活性，在水解小分子糖的过程中，又会转苷产生新的三糖和四糖等。生产中为了减少副产物的生成，往往需要延长反应时间使水解反应达到平衡，一方面导致生产周期长、效率低，另一方面反应时间的延长，又容易导致生成的麦芽糖被重新利用形成转苷副产物。因此，本专利技术利用蛋白质工程和酶工程手段，降低该酶转苷活性，减少转化体系中的副产物比例，使具有更高的麦芽糖生产效率，赋予其在工业上更好的应用性能。
技术实现思路
本专利技术提供了一种麦芽糖淀粉酶的突变体，该突变体是B.stearothermophilus的麦芽糖淀粉酶转苷活性中心相关的氨基酸残基的取代，与其亲代的麦芽糖淀粉酶相比，其对麦芽糖具有更快的转化效率以及更少的转化副产物。所述B.stearothermophilus麦芽糖淀粉酶的亲本氨基酸序列与NCBI数据库中的B.stearothermophilus麦芽糖淀粉酶氨基酸序列一致(登录号：AAA22233.1)。所述的突变体是将亲本麦芽糖淀粉酶基因中第177位的色氨酸(Trp)分别突变成了苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)，分别命名为W177F和W177Y。本专利技术突变体酶W177F和W177Y分别用于麦芽糖生产时，在相同酶转化条件下，添加突变体酶W177F在12h达到反应平衡，麦芽糖含量由90.49％提高为95.79％，反应体系中已不含三糖和四糖；添加突变体酶W177Y在8h达到反应平衡，麦芽糖含量由90.49％提高为96.10％，反应体系中已不含三糖和四糖。而添加野生酶转化生产麦芽糖，8h时麦芽糖含量为93.20％，三糖和四糖含量分别为4.10％和0.50％；12h时麦芽糖含量为94.61％，三糖和四糖含量分别为2.57％和0.22％；反应至30h时仍未达到平衡，此时麦芽糖含量为95.45％，三糖和四糖含量分别为0.67％和0.35％。由此可见，添加突变体酶生产麦芽糖，可将反应体系中的三糖和四糖完全降解。添加野生酶的反应体系中，三糖含量随反应进行逐渐降低为0.67％；四糖在12h时达最低值0.22％，但随着反应时间延长，又呈现出重新生成的趋势。因此突变体酶W177F和W177Y在麦芽糖生产应用中，不仅可以大大缩短反应平衡时间，提高麦芽糖生产效率，同时完全降解了副产物中的主要杂质三糖和四糖，简化了色谱分离纯化过程，在高纯度结晶麦芽糖的生产中具有潜在应用优势。附图说明图1野生型麦芽糖淀粉酶和突变体(W177F和W177Y)生产麦芽糖过程中麦芽糖含量变化图2野生型麦芽糖淀粉酶和突变体(W177F和W177Y)生产麦芽糖过程中麦芽三糖含量变化图3野生型麦芽糖淀粉酶和突变体(W177F和W177Y)生产麦芽糖过程中麦芽四糖含量变化图4野生型麦芽糖淀粉酶和突变体(W177F和W177Y)的最适温度图5野生型麦芽糖淀粉酶和突变体(W177F和W177Y)的60℃温度稳定性图6野生型麦芽糖淀粉酶和突变体(W177F和W177Y)的最适pH图7野生型麦芽糖淀粉酶和突变体(W177F和W177Y)的pH稳定性图8金属离子对野生型麦芽糖淀粉酶和突变体(W177F和W177Y)比活力的影响具体实施方式实施例1：本例说明野生麦芽糖淀粉酶的制备。(1)麦芽糖淀粉酶重组菌的构建根据NCBI上的amyM氨基酸序列(NCBI编号：AAA22233.1)，将NCBI上的amyM基因序列(NCBI编号：M36539)进行密码子优化，采用化学全合成方法合成麦芽糖淀粉酶的基因序列amyM。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET24a(+)。将pET24a(+)质粒和带有amyM基因的质粒分别进行NcoⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物经胶回收后，用T4连接酶连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L卡那霉素的LB平板，经37℃培养过夜，平板上挑取2个单菌落，接入LB液体培养基，8h后抽提质粒验证，结果正确，得到富集的amyM/pET24a质粒。将质粒amyM/pET24a转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取转化子在LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中37℃培养过夜，保存甘油管，命名为amyM/pET24a/BL21(DE3)。(2)麦芽糖淀粉酶的表达与纯化从甘油管接种amyM/pET24a/BL21(DE3)于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长8h，按5％接种量将种子接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)。大肠杆菌在37℃培养2h后，加入0.01mM终浓度的IPTG进行诱导，并在25℃摇床继续培养发酵48h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集发酵上清。在上清液中缓慢加入50％(NH4)2SO4,4℃放置过夜，4℃、8000rpm离心20min，收集沉淀。用pH7.5的20mM柠檬酸缓冲液复本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种麦芽糖淀粉酶的突变体，其特征在于，所述麦芽糖淀粉酶的亲本氨基酸序列与NCBI数据库中登录号为AAA22233.1的嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶一致，所述突变是将第177位色氨酸突变为苯丙氨酸，命名为W177F。

【技术特征摘要】
1.一种麦芽糖淀粉酶的突变体，其特征在于，所述麦芽糖淀粉酶的亲本氨基酸序列与NCBI数据库中登录号为AAA22233.1的嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶一致，所述突变是将第177位色氨酸突变为苯丙氨酸，命名为W177F。2.一种麦芽糖淀粉酶的突变体，其特征在于，所述麦芽糖淀粉酶的亲本氨基酸序列与NCBI数据库中登录号为AAA22233.1的嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶一致，所述突变是将第177位色氨酸突变为酪氨酸，命名为W177Y。3.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，段绪果，孙烨橙，王蕾，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32