葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有改进的热稳定性的葡糖淀粉酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及具有改进的热稳定性的葡糖淀粉酶变体。本专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。【专利说明】葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸 对序列表的引用本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及葡糖淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。 相关技术说明葡糖淀粉酶(1，4- a -D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的一种酶。葡糖淀粉酶是由若干丝状真菌和酵母产生的，其中来自曲霉属的那些在商业上是最重要的。在商业上，葡糖淀粉酶被用于将已通过α -淀粉酶部分地水解的淀粉材料转化成葡萄糖。然后可以使用一种发酵有机体将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产品。商业发酵产品的实例包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1，3-丙二醇);有机酸类(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2，5-二酮-D-葡糖酸);酮类(例如，丙酮);氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2);以及更复杂的化合物，包含例如抗生素(例如，盘尼西林和四环素);酶；维生素(例如，核黄素、Β12、β-胡萝卜素);激素以及难以合成生产的其他化合物。发酵过程也通常被用于可食用酒精(例如，啤酒和白酒)、乳制品(例如，用于制造酸奶酪和干酪)工业中。最终产品还可以是糖浆。例如，最终产品可以是葡萄糖，而且还可以例如通过葡萄糖异构酶转化成果糖或由几乎相等地葡萄糖和果糖构成的一种混合物。这种混合物，或另外地富集果糖的一种混合物，是在世界范围内商业化的最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。本专利技术的一个目的是提供多种具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸，并且它们在发酵产物生产工艺，如乙醇生产工艺，包括由未胶凝化生(或未蒸煮的)淀粉进行的一步乙醇发酵工艺中提供高产率。共同未决的专利申请W02011/127802披露了来自草酸青霉菌的野生型葡糖淀粉酶。本专利技术提供了与其亲本相比具有改进的特性的葡糖淀粉酶变体。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术涉及在对应于SEQ ID Ν0:3的多肽的位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、571中的一个或多个位置处包含取代或缺失的葡糖淀粉酶变体，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。在第二方面，本专利技术涉及在对应于SEQ ID Ν0:3的多肽的位置10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468 中的一个或多个位置处包含取代的变体葡糖淀粉酶催化结构域，其中该变体催化结构域具有葡糖淀粉酶活性。在第三方面，本专利技术涉及一种包含本专利技术的变体多肽的组合物。在另外的方面中，本专利技术还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。本专利技术还涉及在糖浆和/或一种发酵产品的生产中使用本专利技术的多肽的方法。定义葡糖淀粉酶:术语葡糖淀粉酶(1，4- a -D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)被定义为催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的一种酶。出于本专利技术的目的，根据在此的‘材料与方法’部分所述的程序来确定葡糖淀粉酶活性。本专利技术的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20%、优选至少40%、优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及甚至最优选至少100%的葡糖淀粉酶活性。在另一个实施例中，本专利技术的多肽具有SEQ IDNO:3的多肽的至少20%、优选至少40%、优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及甚至最优选至少100%的葡糖淀粉酶活性。等位变体:术语“等位变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可变形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无改变)，或可以编码出具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。cDNA:术语“cDNA”是指可以通过得自真核或原核细胞的，从成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。编码序列:术语“编码序列”意指直接指定一个变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般是通过以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束的一个开放读码框来决定。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列:术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或者外源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包括但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达:术语“表达”包括涉及在一个变体的产生中的任何步骤，包含但不局限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体:术语“表达载体”意指包含编码一种变体的一种多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的控制序列的线性或环形DNA分子。片段:术语“片段”意指使一个或多个(例如，若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少的多肽；其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，一个片段含有至少465个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸30至494)。高严谨度条件:术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA 印迹(Southern blotting)程序，在 42°C下在 5XSSPE、0.3%SDS、200 毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡糖淀粉酶变体，在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、571中的一个或多个位置处包含取代或缺失，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：EP弗里斯，L德马里亚，J文德，TA波尔森，A斯文德森，S达尼尔森，RT伦哈德，H弗里斯马德森，LK斯科夫，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK