葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有对蛋白酶切口的减小的敏感度的多种葡糖淀粉酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及具有对蛋白酶切口的减小的敏感度的多种葡糖淀粉酶变体。本专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。【专利说明】葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸 对序列表的引用本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及一种葡糖淀粉酶变体、编码该变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。相关技术说明葡糖淀粉酶(1，4- a -D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。葡糖淀粉酶由若干丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉菌属(Aspergillus)的那些在商业上最为重要。在商业上，葡糖淀粉酶用于将已经由α-淀粉酶部分水解的淀粉转化成葡萄糖。然后可以使用发酵有机体将葡萄糖直接或间接转化成发酵产品。商业发酵产品的实例包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1，3-丙二醇);有机酸类(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2，5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2);以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，盘尼西林和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、Β12、β-胡萝卜素)；激素以及难以合成生产的其他化合物。发酵过程通常还用于可食用酒精(例如，啤酒和酒)工业、乳制品(例如，在酸乳和奶酪的生产中)工业中。最终产品还可以是糖浆。例如，最终产品可以是葡萄糖，但是还可以被葡萄糖异构酶转化成果糖或者由几乎均等的葡萄糖与果糖组成的一种混合物。这种混合物或者进一步富含果糖的一种混合物是全世界商业化的最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。本专利技术的一个目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸，并且这些多肽和多核苷酸在发酵产品的生产过程中提供高产量，这些生产过程例如乙醇生产过程，包括从未糊化的生淀粉(或者未蒸煮的淀粉)的一步乙醇发酵过程。共同未决的专利申请W02011/127802披露了来自草酸青霉菌的野生型葡糖淀粉酶。本专利技术提供了与其亲本相比具有改进的特性的葡糖淀粉酶变体。专利技术概述本专利技术涉及一种葡糖淀粉酶变体，该葡糖淀粉酶变体至少在与SEQ IDN0:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置处包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。在另外的方面，本专利技术涉及一种变体葡糖淀粉酶催化域，该变体葡糖淀粉酶催化域至少在与SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置处包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。在另一方面，本专利技术涉及一种包含本专利技术的多肽的组合物。本专利技术还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。本专利技术还涉及在糖浆和/或一种发酵产品的生产中使用本专利技术的多肽的方法。定义葡糖淀粉酶:术语葡糖淀粉酶(1，4- a -D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)被定义为催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。出于本专利技术的目的，根据在此的‘材料与方法’部分所述的程序来确定葡糖淀粉酶活性。本专利技术的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20%、优选至少40%、优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及最优选至少100%的葡糖淀粉酶活性。等位基因变体:术语“等位基因变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而天然存在，并且可导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化)或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。一个多肽的等位基因变体是由一个基因的等位基因变体编码的多肽。cDNA:术语“cDNA”意指可以通过从成熟的、剪接的mRNA分子反转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞或原核细胞中获得。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。起始的初级RNA转录物是通过一系列步骤加工的mRNA的前体，这些步骤包括在作为成熟剪接的mRNA出现之前进行剪接。编码序列:术语“编码序列”意指直接指定一个变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般是通过以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并以终止密码子(例如TAA,TAG或TGA)结束的一个开放读码框来决定。编码序列可以是一个基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其组合。控制序列:术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列针对编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或者外源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包含但不局限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。这些控制序列至少包含一个启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达:术语“表达”包括涉及在一个变体的产生中的任何步骤，包括但不局限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体:术语“表达载体”意指包含编码一种变体的一种多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的控制序列的线性或环形DNA分子。片段:术语“片段”意指使一个或多个(例如，若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少的多肽，其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，一个片段含有至少465个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸30至494)。 高严格条件:术语“高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，按照标准DNA印迹法程序，在42°C下于5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精DNA以及50%甲酰胺中进行12至24小时的预杂交和杂交。最终，使用2X SSC、0.2%SDS在65°C下洗涤运载体材料三次,每次持续15分钟。宿主细胞:术语“宿主细胞”意指易于用包含本专利技术的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导、等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖了由于在复制过程中存在的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何子代。改进的特性:术语“改进的特性”意指与一种变体相关的相对于亲本有所改进的特征。这类改进的特性包括但不局限于改进的对由宿主蛋白酶所引起的降解或切口的稳定性。改进的稳定性相当于减小的敏感度。优选地，该敏感度减小至少10%、优选至少20%、更优选至少30%、优选至少40%、优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、更优选至少95%、并且甚至最优选至少100%。分离的:术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制实例包括(I)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡糖淀粉酶变体，该变体至少在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置处包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：松井知子，S克拉克，
申请(专利权)人：诺维信公司，诺维信北美公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK