一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法，所述方法包括：将DNA样品打断成片段，并分成第一样品和第二样品；将所述第一样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；将所述处理后的样品变性、复性、去除单链，获得羟甲基化文库捕获促进剂；将所述第二样品与接头连接；将所述连接接头的第二样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；将上步骤中处理的第二样品与所述羟甲基化文库捕获促进剂混合；对所述混合样品进行探针捕获；对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。本发明专利技术的方法可以检测基因组目标区域内CpG的羟甲基化水平，有效提高目标区域内CpG的检测准确性、降低成本。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法。
技术介绍
在甲基转移酶的催化下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)5'碳位以共价键结合一个甲基基团，形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化中5-甲基胞嘧啶(5-mdC)在TET家族酶的催化下发生氧化形成5-羟甲基胞嘧啶(5-hmdC)。5-羟甲基胞嘧啶被称为哺乳动物中的“第六碱基”。5-羟甲基胞嘧啶可以作为稳定的DNA表观遗传修饰参与干细胞和癌症相关基因表达与调控的重大生命活动。由于5-羟甲基胞嘧啶主要分布在增强子和转录起始位点附近，因而它对基因的转录有很大影响，而5hmC的含量又受到Tet蛋白的调节，因此基因的表达调控在很大程度上会受到Tet蛋白和5-羟甲基胞嘧啶的影响，作用机制为5-羟甲基胞嘧啶通过降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域与甲基化DNA的亲和性，来参与基因的表达调控，同时它还参与了DNA去甲基化过程。并且，在众多的疾病中均有发现5-羟甲基胞嘧啶的紊乱，如黑色素瘤、帕金森症等。一些基因组上重要区域的5-羟甲基胞嘧啶水平的变化，已经被作为疾病诊断和预后的分子标标志物，5-羟甲基胞嘧啶和另外一种起修饰作用的DNA碱基5-甲基胞嘧啶(5-mC)很相似，但它们之间的差异受到化学技术的限制一直无法分辨，因此开发对目标区域单碱基分辨率的5-羟甲基胞嘧啶检测技术显得尤为重要。目前虽然已有一些方法可以实现对全基因组范围单碱基分辨率的5-羟甲基胞嘧啶的检测，如TAB-Seq、oxBS-Seq技术，但是尚缺乏对5-羟甲基胞嘧啶基因组目标区域的检测技术。
技术实现思路
为了实现准确、有针对性地对5-羟甲基胞嘧啶水平的检测，专利技术人提出了一种单碱基分辨率的目标区域5-羟甲基胞嘧啶检测技术。因此，本专利技术提供了一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法，所述方法包括：(1)将DNA样品打断成片段，并分成第一样品和第二样品；(2)将所述第一样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；(3)将所述处理后的样品变性、复性、去除单链，获得羟甲基化文库捕获促进剂；(4)将所述第二样品与接头连接；(5)将所述连接接头的第二样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；(6)将步骤(5)中处理的第二样品与步骤(3)获得的羟甲基化文库捕获促进剂混合；(7)对所述混合样品进行探针捕获；(8)对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。在一个实施方案中，在步骤(4)中在所述第二样品中加入双链序列后再进行接头连接，所述双链序列为：oligoA：5’-3’ATC*GGGATGCTACC&GATGCC*GATCAATGCAATGCATGCATGGACCGATCGACATTC*GGACCTATGACCTGCAATGCATGGCATGATCC*GCTGAC&GACTGAC*GTCGATTC*GGAGCTAGATColigoB：5’-3’GATCTAGCTCC*GAATCGAC*GTCAGTC&GTCAGC*GGATCATGCCATGCATTGCAGGTCATAGGTCC*GAATGTCGATCGGTCCATGCATGCATTGCATTGATC*GGCATC&GGTAGCATCCC*GAT*代表羟甲基化位点，&代表甲基化位点。在一个实施方案中，在步骤(4)中在连接接头之前有加“A”的步骤。在一个实施方案中，所述接头的两条链为，Hydro-Adapter-1:GATC*GGAAGAGC*AC*AC*GTC*TGAAC*TC*C*AGTC*AC*Hydro-Adapter-2:AC*AC*TC*TTTC*C*C*TAC*AC*GAC*GC*TC*TTC*C*GATC*T。在一个实施方案中，在步骤(5)中亚硫酸盐处理后包括扩增步骤，扩增引物为：TPE1.0：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTPE2.0：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATindexGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。在一个实施方案中，在步骤(7)中，设计探针时采用简并策略，由于CpG上的C存在以下3种状态：未发生甲基化，经βGT、TET酶和亚硫酸盐处理后转化为U对应探针上的碱基为T；发生甲基化，经经βGT、TET酶和亚硫酸盐处理后转化为U对应探针上的碱基为T；发生羟甲基化经，经βGT、TET酶和亚硫酸盐处理后，对应探针上的碱基仍为C，因此当遇到CpG碱基时，把C改为C/T这两种简并碱基，探针上CG不超过3个，优选不含CG的序列。CA、CT、CC上的C改为T,其他位置上的A、T和G都按照碱基互补配对原则进行设计。在一个实施方案中，在步骤(7)中，所述探针与目标序列互补序列的TM值范围在65℃-85℃，优选75℃。在一个实施方案中，在步骤(7)中，探针的长度为90-120nt，优选100nt。在一个实施方案中，在步骤(7)中，针对所述双链片段的的探针序列分别为：5’-3’ATCGGGATGTTATTGATGTCGATTAATGTAATGTATGTATGGATTGATTGATATTCGGATTTATGATTTGTAATGTATGGTATGATTCGTTGATGATTGA；5’-3’GATTTAGTTTCGAATTGACGTTAGTTGTTAGCGGATTATGTTATGTATTGTAGGTTATAGGTTCGAATGTTGATTGGTTTATGTATGTATTGTATTGATC。在一个实施方案中，在步骤(8)后包括分析测序结果的步骤，以如下方式确定羟甲基化位点：羟甲基化水平＝测序结果的到C碱基总数/(测序结果得到C碱基总数+测序结果得到的T碱基总数)。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方案仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。以下结合具体实施方案对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。1.羟甲基化文库捕获促进剂制备1.1将样品提取的DNA片段化：用BioruptorPico打断仪表1：样品制备。成分体积基因组DNA量为1μgNuclease-freewater补足至50μl1.2BioruptorPico打断仪1)将基因组DNA按照以上体系转移至0.6mlMaxyClearSnaplockMicrocentrifugeTube内，充分混匀，短暂离心后置于冰上待用；2)提前打开超声打断仪BioruptorPico，待冷循环仪温度降至4℃后，设置参数ON30s，OFF30s为1个循环，每10循环为一轮，共进行3轮，每轮结束后将样品置于振荡器上充分混匀，短暂离心后进行下一轮打断(混匀越充分，打断样品片段大小越集中)；3)取1μl样品使用Agilent2100(DNA1000Assay)进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。1.2β-GT(β-葡萄糖基转移酶)进行糖基化修饰1)准备糖基化反应试剂表-2：糖基化反应体系成分体积来自5.9反应结束的样品20ul10mMUDP-Glucose0.4ul10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法，所述方法包括：(1)将DNA样品打断成片段，并分成第一样品和第二样品；(2)将所述第一样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；(3)将所述处理后的样品变性、复性、去除单链，获得羟甲基化文库捕获促进剂；(4)将所述第二样品与接头连接；(5)将所述连接接头的第二样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；(6)将步骤(5)中处理的第二样品与步骤(3)获得的羟甲基化文库捕获促进剂混合；(7)对所述混合样品进行探针捕获；(8)对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。

【技术特征摘要】
1.一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法，所述方法包括：(1)将DNA样品打断成片段，并分成第一样品和第二样品；(2)将所述第一样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；(3)将所述处理后的样品变性、复性、去除单链，获得羟甲基化文库捕获促进剂；(4)将所述第二样品与接头连接；(5)将所述连接接头的第二样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；(6)将步骤(5)中处理的第二样品与步骤(3)获得的羟甲基化文库捕获促进剂混合；(7)对所述混合样品进行探针捕获；(8)对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。2.根据权利要求1的方法，在步骤(4)中在所述第二样品中加入双链序列后再进行接头连接，所述双链序列为：oligoA：5’-3’ATC*GGGATGCTACC&GATGCC*GATCAATGCAATGCATGCATGGACCGATCGACATTC*GGACCTATGACCTGCAATGCATGGCATGATCC*GCTGAC&GACTGAC*GTCGATTC*GGAGCTAGATColigoB：5’-3’GATCTAGCTCC*GAATCGAC*GTCAGTC&GTCAGC*GGATCATGCCATGCATTGCAGGTCATAGGTCC*GAATGTCGATCGGTCCATGCATGCATTGCATTGATC*GGCATC&GGTAGCATCCC*GAT*代表羟甲基化位点，&代表甲基化位点。3.根据权利要求1的方法，在步骤(4)中在连接接头之前有加“A”的步骤。4.根据权利要求1的方法，所述接头的两条链为，Hydro-Adapter-1:GATC*GGAAGAGC*AC*AC*GTC*TGAAC*TC*C*AGTC*AC*Hydro-Adapter-2:AC*A...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁加龙，韩京京，余越美，张坤，蔡万世，
申请(专利权)人：艾吉泰康生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11