一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在待测的至少两个靶标基因的序列中分别增加、修改或删除至少一个碱基制备标准模板；再将所述标准模板克隆至载体中合成载体，然后将所述合成载体扩增并纯化；再将所述合成载体的纯化产物等摩尔量混合，形成混合标准品。本发明专利技术的基于高通量测序技术的基因定量测序方法实现了在同时对多个靶标基因的定量检测，提高了检测效率，并保证了准确率，耗时短，节约了检测测序成本。

【技术实现步骤摘要】
一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法
本专利技术涉及基因定量测序
，具体涉及一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法。
技术介绍
PCR(聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同，具有高效性、系统性、经济便捷性等特点。荧光定量PCR是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种基因定量检测技术，它是通过PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。或者使用荧光染料SYBR。SYBR可以结合到双链DNA上面，当体系中的模板被扩增时，SYBR可以有效结合到新合成的双链上面，随着PCR的进行，结合的SYBR染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量检测的目的。但是目前阶段，荧光定量PCR技术一般一个反应只能检测一个靶标基因，检测效率较低，并且一般常用于mRNA的水平检测，适用范围较小。目前，高通量测序技术已广泛应用，能够同时对多个靶标基因进行测序，建库过程需要进行多重PCR，而由于引物扩增效率或者实验等等问题，多重PCR过程中存在不同引物在一次实验中扩增效率差异数倍，以及同一引物在不同的实验中差异数倍的情况，从而导致检测目的基因表达或者CNV的数据时被差异覆盖的情况，即使是通过管家基因也无法很好校正这种差异，使得基于高通量测序对多个靶标同时定量测序检测效率低，准确率低，耗时长，成本高。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种检测效率高，准确率高，耗时短，成本低的基于高通量测序技术的基因定量测序方法。为实现上述目的，本专利技术实施例的技术方案如下：一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法，所述方法包括以下步骤：在所述待测的至少两个靶标基因的序列中分别增加、修改或删除至少一个碱基制备标准模板；再将所述标准模板分别克隆至载体中制备合成载体，然后将所述合成载体进行多重PCR扩增和纯化；再将所述合成载体的纯化产物等摩尔量混合得到合成载体混合物；进一步地，所述的一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法可以包括以下步骤：S1：对待测的至少两个靶标基因进行浓度定量检测；S2：在所述待测的至少两个靶标基因的序列中分别增加、修改或删除至少一个碱基制备标准模板；再将所述标准模板分别克隆至载体中制备合成载体，然后将所述合成载体进行多重PCR扩增和纯化；再将所述合成载体的纯化产物等摩尔量混合得到合成载体混合物；S3：将合成载体混合物与靶标基因共同进行多重PCR扩增、纯化和回收；S4：将步骤S3中多重PCR扩增的回收产物进行高通量测序分析，将每一个合成载体及每一个合成载体对应的靶标基因进行分类统计，计算合成载体与合成载体对应的靶标基因的相对表达量。优选地，所述步骤S1中对待测的至少两个靶标基因进行定量检测可以荧光分析试剂盒(如dsDNAHSAssayKit)。其中，所述步骤S2的靶标基因的序列中增加、修改或删除碱基，所述增加、修改或删除的位置需位于测序范围内，以不影响扩增效率，又能被准确识别出为前提。优选地，靶标基因的序列每100个碱基中增加、修改或删除3-20个碱基。优选地，所述步骤S2中的载体为质粒，所述质粒可以为Puc57等。其中，所述步骤S2中所述合成载体进行多重PCR扩增的反应体系可以为常用体积的反应体系。优选地，所述反应体系为30μL，包括如下组分：20-100μmol/L的合成载体引物1-8μL、10ng合成载体、扩增试剂盒/扩增酶8-20μL，余量为无核酸酶水。优选地，步骤S2中所述合成载体进行多重PCR扩增程序为：热启动条件为96℃3min；15-30个循环条件为96℃30sec，60℃30sec；延伸条件为72℃2min。优选地，所述步骤S2中所述合成载体进行多重PCR扩增产物的纯化步骤如下：1)在PCR产物中加1倍体积磁珠(即30μL体系加30μL)用移液器上下吹打，使回收产物与AMPureXP磁珠充分混匀。室温静置5-10分钟。用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器吸取上清，抛弃上清，保留磁珠。2)加入50-150μL70wt％-80wt％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠以便洗涤。用磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。3)室温放置，直至乙醇挥发干净。本步骤亦可将磁珠放于烘箱内快速蒸干乙醇。优选地，所述速蒸干乙醇的条件为将磁珠放于40-55℃烘箱2-6min。4)加入20-100μL洗脱缓冲液，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA。将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清DNA溶液吸至新的1.5/0.5/0.2mL离心管/96孔PCR管。所述的洗脱缓冲液优选为10mMTris-HCl，pH8.0-8.5或TE。优选地，所述磁珠为可商购获得的AMPureXP磁珠。优选地，再将所述合成载体的纯化产物定量，等摩尔量混合后得到合成载体混合物。优选地，每次使用合成载体混合物时，取1ng稀释10-7-10-5倍使用。更优选地，每次使用合成载体混合物时，取1ng稀释10-6倍使用。优选地，所述步骤S3中合成载体混合物与靶标基因按摩尔量的0.1-10倍混合。优选地，所述步骤S3中进行多重PCR扩增包括两轮扩增程序：其中，第一轮扩增程序中的反应体系可以为常用体积的反应体系，优选地，所述反应体系为30μL，包括如下组分：5-50nmol/μL第一扩增引物组5-8μL、靶标基因可以为10-250ng，优选为20-200ng、每ng稀释10-7-10-5倍的合成载体混合物2-6μL、扩增试剂盒/扩增酶8-15μL，余量为无核酸酶水。优选地，步骤S3中所述多重PCR第一轮扩增程序为：热启动条件为96℃3min；15-28个循环条件为96℃30sec，60℃4min，其中，若靶标基因为10-20ng，可以适当增加1-2循环；延伸条件为72℃2min。优选地，所述步骤S3中所述多重PCR第一轮扩增产物的纯化步骤如下：1)在所述中加入反应体系体积1-1.5倍的磁珠(30μL体系加30-45μL)，用移液器上下吹打，使第一轮扩增产物与AMPureXP磁珠充分混匀。室温静置3-10min。2)用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。3)抛弃上清，保留磁珠。4)加入50-150μL70wt％-80wt％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠以便洗涤。5)用磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。6)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在待测的至少两个靶标基因的序列中分别增加、修改或删除至少一个碱基制备标准模板；再将所述标准模板克隆至载体中制备合成载体，然后将所述合成载体扩增并纯化；再将所述合成载体的纯化产物等摩尔量混合，得到合成载体混合物。

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在待测的至少两个靶标基因的序列中分别增加、修改或删除至少一个碱基制备标准模板；再将所述标准模板克隆至载体中制备合成载体，然后将所述合成载体扩增并纯化；再将所述合成载体的纯化产物等摩尔量混合，得到合成载体混合物。2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：对待测的至少两个靶标基因进行浓度定量检测；S2：在所述待测的至少两个靶标基因的序列中分别增加、修改或删除至少一个碱基制备标准模板；再将所述标准模板分别克隆至载体中制备合成载体，然后将所述合成载体进行多重PCR扩增和纯化；再将所述合成载体的纯化产物等摩尔量混合得到合成载体混合物；S3：将合成载体混合物与靶标基因共同进行多重PCR扩增、纯化和回收；S4：将步骤S3中多重PCR扩增的回收产物进行高通量测序分析，将每一个合成载体及每一个合成载体对应的靶标基因进行分类统计，计算合成载体与合成载体对应的靶标基因的相对表达量。3.根据权利要求2所述的一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法，其特征在于，所述步骤S2的靶标基因的序列中每100个碱基中增加、修改或删除3-20个碱基。4.根据权利要求2所述的一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法，其特征在于，所述步骤S2中所述合成载体进行多重PCR扩增的反应体系为30μL，包括如下组分：20-100μmol/L的合成载体引物1-8μL、10ng合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建全，杨吉元，
申请(专利权)人：上海优甲医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31