产生核酸库的方法技术

提供了产生核酸库的方法。在某些方面，所述方法包含：组合靶核酸(例如，5'磷酰化核酸)和寡核苷酸池。所述寡核苷酸池的寡核苷酸可以包含不同长度和核苷酸序列的互补区域以及互补区域识别序列。在这种方面，所述组合是在以下条件下进行的：所述寡核苷酸池的寡核苷酸与所述靶核酸中的核酸(例如，5'磷酰化核酸)杂交，所述核酸具有在序列上互补并且相对于所述寡核苷酸的所述互补区域具有对应长度的突出端区域。还提供了可用于例如实践本公开的所述方法的组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生核酸库的方法关于联邦政府资助的研究的声明本专利技术是在国家科学基金会授予的合同号1513501的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术中的某些权利。相关专利申请本专利申请要求于2016年7月15日提交的题目为“产生核酸库的方法”，命名RichardE.Green为第一命名专利技术人，并由代理人案卷号UCSC-350PRV指定的美国临时专利申请号62/362,904的权益。上述申请的全部内容通过引用并入本文，包含所有文本、表格和附图。
技术介绍
DNA测序的最新进展已经彻底改变了基因组学领域，使甚至单个研究组非常快速并以低得多的成本生成大量序列数据成为可能。这些高通量测序技术可使更多的研究人员和项目获得深度转录组测序和转录本量化、全基因组测序和重测序。存在各种商业高通量测序平台，并且例如在Metzker，M.L.(2010)《自然评论遗传学(Nat.Rev.Genet.)》11:31-46，Morey等人(2013)《分子遗传学和代谢学(Mol.Genet.Metab.)》110:3–24，Reuter等人(2015)《分子细胞(MolecularCell)》58(4):586-597中，以及其它地方描述。在Illumina平台中，测序过程涉及在载玻片表面上克隆扩增衔接子连接的DNA片段。使用循环可逆终止策略读取碱基，其通过渐进的碱基掺入、洗涤、成像和切割一次一个核苷酸对模板链进行测序。在此策略中，荧光标记的3'-O-叠氮基甲基-dNTP用于暂停聚合反应，能够移除未掺入的碱基和荧光成像以确定添加的核苷酸。在用耦合电荷装置(CCD)照相机扫描流动池之后，移除荧光部分和3'嵌段，并重复所述过程。近年来已经取得重大进展的新兴单分子策略是基于纳米孔的测序，牛津纳米孔技术领导此方法的开发和商业化。纳米孔测序主要依赖于DNA或单个核苷酸通过小通道的转变。测序流动池包含数百个独立的微孔，每个微孔含有由生物纳米孔穿孔的合成双层。通过测量当碱通过分子运动蛋白穿过孔时诱导的电流的特性变化来完成测序。库制备是最小的，涉及DNA的片段化和衔接子的连接，并且可以在有或没有PCR扩增的情况下进行。库设计允许对来自单个分子的两条DNA链进行测序，这提高了准确性。为特定类型的实验选择合适的测序平台是重要的考虑因素，并且需要详细了解可用的技术，包含误差来源、错误率、以及测序的速度和成本。虽然测序成本已经急剧下降，但库制备的通量和成本现在是限制性因素。
技术实现思路
提供了产生核酸库的方法。在某些方面，所述方法包含组合靶核酸和寡核苷酸池。所述寡核苷酸池的每个寡核苷酸可以包含(i)能够与靶核酸中的突出端杂交的互补区域，和(ii)互补区域识别多核苷酸。所述池中的寡核苷酸可以包含不同长度的互补区域，并且互补区域识别多核苷酸可以对互补区域的长度具有特异性(并且可以对互补区域的其它特征具有特异性)。在这种方面，在所述寡核苷酸中的互补区域与具有对应长度的所述靶核酸中的突出端杂交的条件下组合，由此形成(例如核酸库)的杂交产物。在某些方面，所述方法包含组合5'磷酰化核酸和寡核苷酸池。所述寡核苷酸池的寡核苷酸可以包含不同长度和核苷酸序列的互补区域以及互补区域识别序列。在这种方面，所述组合是在所述寡核苷酸池的寡核苷酸与所述5'磷酰化核酸的核酸杂交的条件下进行的，所述5'磷酰化核酸具有在序列上互补并且相对于所述寡核苷酸的所述互补区域具有对应长度的突出区域。还提供了组合物和发现例如，在实践本公开的所述方法中使用的试剂盒。附图说明图1示意性地示出了根据本公开的一个实施例的产生核酸库的方法。图2描绘了使用根据本公开的实施例的方法获得的测序读数的数量。图3描绘了使用根据本公开的实施例的方法制备的库中的错配率。图4示出了从健康供体的血浆和尿液纯化的DNA片段的长度分布。图5示出了从健康血浆cfDNA观察到的每种DNA突出端类型和长度的计数。图6示出了从健康尿液cfDNA观察到的每种DNA突出端类型和长度的计数。图7示出了发夹条形码衔接子的示意图。可切割位点可以含有化学可切割位点或酶促可切割位点。条形码表示单链突出端的类型和长度。图8示出了从毛干回收的DNA片段的长度。上图：从140年历史的无根毛发提取物回收的DNA片段被定位到人类基因组。几乎所有的片段都长度小于50bp。下图：从新鲜毛发提取的DNA的测序库长度的证据痕迹。此长度包含约110bp的测序衔接子。因此，即使在新鲜的毛发中，大多数DNA片段长度小于50bp。图9示出了来自13种标准CODIS标记的最短PCR产物的扩增子长度。因为这些标记是长度多态性，所以选择人类中存在的最小扩增子用于可从PowerPlex1.1或16、ProfilerPlus、COfiler或Identifier引物组获得的PCR引物组。甚至迷你STR也需要超出通常在毛干中的核DNA中看到的大小范围的模板分子(图8)。数据来自万维网统一资源定位器cstl.nist.gov/strbase。具体实施方式提供了产生核酸库的方法。在某些方面，所述方法包含组合靶核酸和寡核苷酸池。所述寡核苷酸池的每个寡核苷酸可以包含(i)能够与靶核酸中的突出端杂交的互补区域，和(ii)互补区域识别多核苷酸。所述池中的寡核苷酸可以包含不同长度的互补区域，并且互补区域识别多核苷酸可以对互补区域的长度具有特异性(并且可以对互补区域的其它特征具有特异性)。在这种方面，在所述寡核苷酸中的互补区域与具有对应长度的所述靶核酸中的突出端杂交的条件下组合，由此形成(例如核酸库)的杂交产物。在某些方面，所述方法包含组合5'磷酰化核酸和寡核苷酸池。所述寡核苷酸池的寡核苷酸可以包含不同长度和核苷酸序列的互补区域以及互补区域识别序列。在这种方面，所述组合是在所述寡核苷酸池的寡核苷酸与所述5'磷酰化核酸的核酸杂交的条件下进行的，所述5'磷酰化核酸具有在序列上互补并且相对于所述寡核苷酸的所述互补区域具有对应长度的突出区域。还提供了组合物和发现例如，在实践本公开的所述方法中使用的试剂盒。在更详细地描述本公开的方法、组合物和试剂盒之前，应当理解方法、组合物和试剂盒不限于所描述的特定实施例，因为这种当然可以改变。还应当理解的是，因为方法、组合物和试剂盒的范围将仅由所附权利要求书限定，所以本文中所使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的。在提供取值范围的情况下，应当理解的是，在所述范围的上限与下限之间的每个插入值(到下限的十分之一单位除非上下文清楚地另外指明)以及在所陈述范围内的任何其它所陈述的值或插入值均被涵盖在方法、组合物和试剂盒之内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包含在更小范围之内，并且也被涵盖在方法、组合物和试剂盒之内，服从于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述的范围包含限制中的一者或两者的情况下，排除了那些被包含的限制中的任一者或两者的范围也包含在方法、组合物和试剂盒之内。某些范围在本文以前面出现术语“约”的数值呈现。术语“约”在本文用于为其后面出现的精确数值以及接近或靠近术语后面的数值的数提供文字性支持。在确定数值是否接近或靠近具体叙述的数值时，接近或靠近未叙述的数值可以为这样的数值，其在出现的上下文中，提供与具体叙述的数值基本上等同的方式。除非另外定义，否则本文使用的所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生核酸库的方法，其包括：组合以下：包括靶核酸的核酸组合物，其中所述靶核酸中的一些或全部包括突出端；以及包括寡核苷酸的寡核苷酸池，其中：所述寡核苷酸中的一些或全部包括(i)能够与靶核酸中的突出端杂交的互补区域和(ii)互补区域识别多核苷酸，所述池中包括互补区域的所述寡核苷酸包含不同长度的互补区域，并且所述互补区域识别多核苷酸对所述互补区域的一个或多个特征具有特异性，其中所述一个或多个特征包括所述互补区域的长度；所述组合的条件为所述寡核苷酸中的互补区域与所述靶核酸中具有对应长度的突出端杂交，由此形成核酸库的杂交产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.15 US 62/362,9041.一种用于产生核酸库的方法，其包括：组合以下：包括靶核酸的核酸组合物，其中所述靶核酸中的一些或全部包括突出端；以及包括寡核苷酸的寡核苷酸池，其中：所述寡核苷酸中的一些或全部包括(i)能够与靶核酸中的突出端杂交的互补区域和(ii)互补区域识别多核苷酸，所述池中包括互补区域的所述寡核苷酸包含不同长度的互补区域，并且所述互补区域识别多核苷酸对所述互补区域的一个或多个特征具有特异性，其中所述一个或多个特征包括所述互补区域的长度；所述组合的条件为所述寡核苷酸中的互补区域与所述靶核酸中具有对应长度的突出端杂交，由此形成核酸库的杂交产物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述互补区域的所述一个或多个特征进一步包括(i)5'突出端；(ii)3'突出端；(iii)特定序列；(iv)(i)和(iii)的组合；或(v)(ii)和(iii)的组合。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶核酸中的一些不包括突出端。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述寡核苷酸中的一些不包括互补区域并且包括对互补区域不具有特异性的识别多核苷酸。5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中包括突出端的所述靶核酸包括双链部分和单链突出端。6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中包括突出端的每个靶核酸在一个末端处包括突出端或在两个末端处包括突出端。7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中包括突出端的每个靶核酸的末端或两个末端独立地包括5'突出端或3'突出端。8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是核糖核酸(RNA)或由RNA产生。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述RNA是从细胞中获得的。10.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或是由DNA产生的。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述DNA是从细胞中获得的。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述DNA是基因组DNA或是由基因组DNA产生的。13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是从来自动物的样品中获得的。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述动物是灭绝动物。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述动物来自人属。17.根据权利要求1到8、10、13到16中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是无细胞核酸或是由无细胞核酸产生的。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述无细胞核酸是从选自以下的体液样品中获得的：全血、血浆、血清、羊水、唾液、尿、胸膜积液、支气管灌洗液、支气管吸出物、母奶、初乳、眼泪、精液、腹膜液、胸腔积液和粪便。19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述无细胞核酸包括无细胞胎儿DNA。20.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述无细胞核酸包括循环癌DNA。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述无细胞核酸包括循环肿瘤DNA。22.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述无细胞核酸包括宿主DNA和非宿主DNA。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述非宿主DNA来自传染剂。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述非宿主DNA来自移植物。25.根据权利要求1到24中任一项所述的方法，其中靶核酸中的突出端是天然突出端。26.根据权利要求1到25中任一项所述的方法，其中在与所述池组合之前，所述靶核酸的长度未被修饰。27.根据权利要求1到26中任一项所述的方法，其包括：在将所述核酸组合物与所述池组合之前，通过基本上由从样品中分离核酸组成的过程制备所述组合物，由此生成所述核酸组合物。28.根据权利要求1到26中任一项所述的方法，其包括：在将所述核酸组合物与所述池组合之前，通过基本上由以下组成的过程制备所述核酸组合物：从样品中分离核酸，由此生成所分离核酸；以及用磷酸盐部分或化学反应性部分修饰所述所分离核酸的一个或两个末端，由此生成所述核酸组合物。29.根据权利要求1到28中任一项所述的方法，其中当与所述池组合时，所述靶核酸处于溶液中。30.根据权利要求1到29中任一项所述的方法，其中靶核酸不处于固定的细胞样品中。31.根据权利要求1到29中任一项所述的方法，其中靶核酸不处于固定的组织样品中。32.根据权利要求1到31中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸池包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括突出端。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述池中的全部寡核苷酸包括突出端。34.根据权利要求32或33所述的方法，其中包括突出端的所述寡核苷酸包括双链部分和单链突出端。35.根据权利要求32到34中任一项所述的方法，其中包括突出端的所述寡核苷酸中的每一个在一个末端处包括突出端或在两个末端处包括突出端。36.根据权利要求32到35中任一项所述的方法，其中包括突出端的所述寡核苷酸中的每一个的末端或两个末端独立地包括5'突出端或3'突出端。37.根据权利要求36所述的方法，其中在末端处，所述突出端包括所述互补区域。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述互补区域识别多核苷酸对包括所述互补区域的所述突出端是5'突出端还是3'突出端具有特异性。39.根据权利要求32到38中任一项所述的方法，其中：所述寡核苷酸池包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括第一链和第二链；并且所述第一链包括第一多核苷酸，并且所述第二链包括与所述第一多核苷酸互补的第二多核苷酸。40.根据权利要求32到38中任一项所述的方法，其中：所述寡核苷酸池包括各自基本上由第一链和第二链组成的寡核苷酸；并且所述第一链包括第一多核苷酸，并且所述第二链包括与所述第一多核苷酸互补的第二多核苷酸。41.根据权利要求32到38中任一项所述的方法，其中：所述寡核苷酸池包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括能够采用发夹结构的一条链；并且所述一条链包括第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸的一部分与所述第二多核苷酸的一部分互补。42.根据权利要求32到38中任一项所述的方法，其中：所述寡核苷酸池包括寡核苷酸，所述寡核苷酸各自基本上由能够采用发夹结构的一条链组成；并且所述寡核苷酸包括第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸的一部分与所述第二多核苷酸的一部分互补。43.根据权利要求32到42中任一项所述的方法，其中所述池包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括由三个或更多个核苷酸碱基构成的突出端。44.根据权利要求32到43中任一项所述的方法，其中所述池中的所述寡核苷酸包括长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸或其组合的突出端。45.根据权利要求32到44中任一项所述的方法，其中所述池包括：寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为1个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为2个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为3个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为4个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为5个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为6个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为7个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为8个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为9个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为10个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为11个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为12个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为13个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为14个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为15个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域；或其组合。46.根据权利要求32到45中任一项所述的方法，其中所述池包括：寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为1个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为1个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为2个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为2个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为3个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为3个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为4个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为4个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为5个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为5个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为6个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为6个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为7个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为7个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为8个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为8个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为9个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为9个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为10个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为10个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为11个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为11个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为12个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为12个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为13个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为13个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为14个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为14个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；以及寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为15个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为15个核苷酸的5'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；或其部分。47.根据权利要求32到46中任一项所述的方法，其中所述池包括：寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为1个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为2个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为3个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为4个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为5个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为6个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为7个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为8个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为9个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为10个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为11个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为12个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为13个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为14个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；寡核苷酸的子集，其包括与靶核酸中长度为15个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域；或其组合。48.根据权利要求32到47中任一项所述的方法，其中所述池包括：寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为1个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为1个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为2个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为2个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为3个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为3个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为4个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为4个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为5个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为5个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为6个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为6个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为7个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为7个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为8个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为8个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为9个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为9个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为10个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为10个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为11个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为11个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为12个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为12个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为13个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为13个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为14个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为14个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；以及寡核苷酸的子集，其包括(i)与靶核酸中长度为15个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域和(ii)对与所述靶核酸中长度为15个核苷酸的3'突出端杂交的互补区域具有特异性的互补区域识别多核苷酸；或其部分。49.根据权利要求32到48中任一项所述的方法，其中所述池的所述寡核苷酸中的突出端包括能够与所述靶核酸中的碱基进行特异性碱基配对的核苷酸。50.根据权利要求49所述的方法，其中所述池的所述寡核苷酸中的突出端包括核苷酸，所述核苷酸包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶中的两种或更多种。51.根据权利要求49或50所述的方法，其中所述寡核苷酸池包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括特定突出端长度的不同突出端多核苷酸。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述寡核苷酸池包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括特定突出端长度的所有可能的突出端多核苷酸组合。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述寡核苷酸池包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括每个突出端长度的所有可能的突出端多核苷酸组合。54.根据权利要求49到53中任一项所述的方法，其中所述池的所述寡核苷酸中的所述突出端多核苷酸是随机的。55.根据权利要求32到54中任一项所述的方法，其中所述池的所述寡核苷酸中的突出端包括能够与所述靶核酸中的碱基进行非特异性碱基配对的核苷酸。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述池的所述寡核苷酸中的突出端包括硝基吲哚、脱氧肌苷或其组合。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述硝基吲哚是5-硝基吲哚。58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述脱氧肌苷是2-脱氧肌苷。59.根据权利要求32到58中任一项所述的方法，其中寡核苷酸的末端能够与靶核酸的、所述寡核苷酸在所述杂交产物中与其杂交的末端共价连接。60.根据权利要求59所述的方法，其中寡核苷酸链的3'末端能够与所述靶核酸中的链的、所述寡核苷酸在杂交产物中与其杂交的5'末端共价连接。61.根据权利要求32到60中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的邻近于所述互补区域的区域包括所述互补区域识别多核苷酸的全部或一部分。62.根据权利要求61所述的方法，其中所述池中的所述寡核苷酸在与具有与靶核酸杂交的突出端的末端相对的末端处包括相对突出端。63.根据权利要求62所述的方法，其包括：在所述组合之后填充所述相对突出端。64.根据权利要求32到63中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸池的所述寡核苷酸包括除所述互补区域和所述互补区域识别多核苷酸之外的部分。65.根据权利要求64所述的方法，其中除所述互补区域和所述互补区域识别多核苷酸之外的部分包括核酸结合结构域。66.根据权利要求65所述的方法，其中所述核酸结合结构域是引物结合结构域。67.根据权利要求65或66所述的方法，其中除所述互补区域和所述互补区域识别多核苷酸之外的部分包括测序衔接子的全部或一部分。68.根据权利要求32到67中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸池的所述寡核苷酸包括一个或多个非天然核苷酸。69.根据权利要求68所述的方法，其中所述寡核苷酸的所述互补区域的一个或多个核苷酸是非天然核苷酸。70.根据权利要求69所述的方法，其中所述寡核苷酸的所述互补区域的每一个核苷酸是非天然核苷酸。71.根据权利要求68到70中任一项所述的方法，其中所述非天然核苷酸是锁核酸(LNA)核苷酸。72.根据权利要求32到71中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包括一个或多个主链修饰。73.根据权利要求1到31和32到72中任一项所述的方法，其包括：将所述杂交产物暴露于所述靶核酸的末端与所述寡核苷酸的、所述末端与其杂交的末端连接的条件下。74.根据权利要求1到31、32到72和73中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述靶核酸是5'磷酰化的。75.根据权利要求1到31、32到72、73和74中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸池的寡核苷酸未被磷酰化。76.根据权利要求1到31、32到72和73到75中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸池的寡核苷酸是磷酰化的。77.根据权利要求1到31、32到72和73到76中任一项所述的方法，其包括：在将所述核酸组合物与所述寡核苷酸池组合之前，使所述组合物中的所述靶核酸在将5'磷酸盐加入到靶核酸的5'末端的条件下与包括磷酰基转移活性的试剂接触。78.根据权利要求1到31、32到72和73到76中任一项所述的方法，其包括：在将所述核酸组合物与所述寡核苷酸池组合之前，使所述组合物中的所述靶核酸不与包括磷酰基转移活性的试剂接触。79.根据权利要求1到31、32到72和73到78中任一项所述的方法，其包括：在将所述核酸组合物与所述寡核苷酸池组合之前，使所述池中的所述寡核苷酸不与包括磷酰基转移活性的试剂接触。80.根据权利要求73到79中任一项所述的方法，其包括：使所述杂交产物在靶核酸的末端与所述寡核苷酸的、所述靶核酸与其杂交的末端共价连接的条件下与包括连接酶活性的试剂接触。81.根据权利要求80所述的方法，其中所述杂交产物与包括第一连接酶活性的第一试剂和包括不同于所述第一连接酶活性的第二连接酶活性的第二试剂接触。82.根据权利要求81所述的方法，其中所述第一连接酶活性和所述第二连接酶活性独立地选自以下：平末端连接酶活性、切口密封连接酶活性、粘性末端连接酶活性、环化连接酶活性和粘着末端连接酶活性。83.根据权利要求1到31、32到72和73中任一项所述的方法，其中：所述寡核苷酸中的每一个的末端包括第一化学反应性部分，并且所述靶核酸中的每一个的末端包含第二化学反应性部分；并且所述第一化学反应性部分能够与所述第二化学反应性部分反应并且在寡核苷酸与所述寡核苷酸与其杂交的靶核酸之间形成共价键。84.根据权利要求83所述的方法，其包括：在将所述核酸组合物与所述寡核苷酸池组合之前，使所述组合物中的所述靶核酸在所述第二化学反应性部分结合在所述靶核酸中的每一个的末端处的条件下与一种或多种化学试剂接触。85.根据权利要求83或84所述的方法，其包括：使所述杂交产物连同一种或多种化学试剂暴露于所述第一化学反应性部分与所述第二化学反应性部分反应从而在寡核苷酸与所述寡核苷酸与其杂交的靶核酸之间形成共价键的条件。86.根据权利要求83到85中任一项所述的方法，其中所述第一化学反应性部分能够与所述第二化学反应性部分反应以在所述寡核苷酸与所述寡核苷酸与其杂交的所述靶核酸之间形成1,2,3-三唑。87.根据权利要求83到86中任一项所述的方法，其中所述第一化学反应性部分能够在包括铜的条件下与所述第二化学反应性部分反应。88.根据权利要求83到87中任一项所述的方法，其中所述第一化学反应性部分选自含叠氮化合物的部分和5-辛二炔基脱氧尿嘧啶，并且所述第二化学反应性部分独立地选自含叠氮化合物的部分、己炔基和5-辛二炔基脱氧尿嘧啶。89.根据权利要求88所述的方法，其中所述含叠氮化合物的部分是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯-叠氮化合物。90.根据权利要求1到31、41到72和73到89中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包括能够采用发夹结构的一条链，其中所述一条链包括第一多核苷酸、第二多核苷酸和能够在切割条件下切割的一个或多个切割位点。91.根据权利要求1到31、41到72和73到89中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸基本上由能够采用发夹结构的一条链组成，其中所述一条链包括第一多核苷酸、第二多核苷酸和能够在切割条件下切割的一个或多个切割位点。92.根据权利要求90或91所述的方法，其中所述第一多核苷酸包括与所述第二多核苷酸中的第一区域互补的第一区域，并且所述第一多核苷酸包括与所述第二多核苷酸中的第二区域不互补的第二区域。93.根据权利要求90、91或92所述的方法，其中所述一个或多个切割位点位于所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸之间。94.根据权利要求90到93中任一项所述的方法，其中所述一个或多个切割位点包括尿嘧啶和/或脱氧尿苷核苷酸。95.根据权利要求90到93中任一项所述的方法，其中所述一个或多个切割位点包括二醇。96.根据权利要求95所述的方法，其中所述二醇是以5'到5'键结合的邻位二醇。97.根据权利要求90到93中任一项所述的方法，其中所述一个或多个切割位点包括限制酶识别位点。98.根据权利要求97所述的方法，其中所述限制酶识别位点是稀有切割酶限制酶识别位点。99.根据权利要求90到98中任一项所述的方法，其包括：在所述组合之后，将所述一个或多个切割位点暴露于...

【专利技术属性】
技术研发人员：理查德·E·格林，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US