一种拉链式可延伸探针在cfDNA文库构建中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种使用拉链式可延伸探针的cfDNA文库构建方法，包括：获得拉链式探针，其3’端包括与目标DNA单链互补配对的15‑20个碱基，5’端包括颈环结构，所述颈环结构中互补配对的碱基数目为18‑50个，所述颈环结构的环部从5’‑3’方向包括A和U碱基；将DNA样品打断成片段，变性成单链DNA；所述拉链式探针与变性后的单链DNA进行连接反应，然后进行延伸并在延伸链的3’端加上A，形成末端封闭的双链DNA复合物；在进行剪切，形成平末端3’都带有A的双链DNA；将所述双链DNA与接头连接；对所述连接接头的双链DNA进行探针捕获；对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。

Application of a Zipper Extensible Probe in Construction of cfDNA Library

The invention discloses a method for constructing a cfDNA library using a zipper extensible probe, which comprises: obtaining a zipper probe with 15 to 20 bases at its 3'end and a neck ring structure at its 5' end. The number of complementary bases in the neck ring structure is 18 to 50, and the ring of the neck ring structure includes A and U bases from the 5'3'direction. Samples are broken into fragments and denatured into single-stranded DNA; the zipper probe reacts with denatured single-stranded DNA, then extends and adds A to the 3'end of the extension chain to form a closed double-stranded DNA complex at the end; after shearing, a double-stranded DNA with A is formed at the flat end of 3'; the double-stranded DNA is connected to the joint; and the double-stranded DNA of the connecting joint is probed. Capture; Sequence the captured sequence to obtain the sequencing result of the captured sequence.

【技术实现步骤摘要】
一种拉链式可延伸探针在cfDNA文库构建中的应用
本专利技术属于生物技术，更具体地，本专利技术提供了一种拉链式可延伸探针在cfDNA文库构建中的应用。
技术介绍
在标准的大规模平行测序中，很难检测到丰度低于2％的突变。要想检测到这些低频突变，需要检测到大量的读段数，这样会直接给测序成本带来极大地提升。这正是目前对血液中ctDNA检测的瓶颈所在。1ml血浆中有1,800-13,000个cfDNA片段，然而ctDNA占有cfDNA含量在0.4-11％。仅通过常规建库测序方法会使ctDNA检测信号完全淹没在背景噪声中，其原因在于，在通常建库过程中，在对末端cfDNA修复的过程中，会在内切酶的作用下切掉3’端序列。并且cfDNA片段化过程不像基因组打断那样随机，如果突变位置发生在cfDNA的3’的近端，按照常规的建库方法，将无法检测到突变位点信息。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了一种使用拉链式可延伸探针的cfDNA文库构建方法，所述方法包括：(1)获得拉链式探针，所述拉链式探针的3’端包括与目标DNA单链互补配对的15-20个碱基，优先选择16个碱基，5’端包括颈环结构，所述颈环结构中互补配对的碱基数目为18-50个，优选20个，所述颈环结构的环部从5’-3’方向包括A和U碱基；(2)将DNA样品打断成片段，变性成单链DNA；(3)所述拉链式探针与变性后的单链DNA进行连接反应，将连接产物进行延伸，并在延伸链的3’端加上A，形成末端封闭的双链DNA复合物；(4)将双链DNA复合物剪切，形成平末端3’都带有A的双链DNA；(5)将所述双链DNA与接头连接；(6)对连接接头的所述双链DNA进行探针捕获；(7)对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。在一个实施方案中，在(3)中在Klenow片段的作用下进行延伸。在一个实施方案中，在(4)中在USER酶的作用下进行剪切。在一个实施方案中，在(5)中所述接头包括分子标签。在一个实施方案中，在(1)中所述拉链式探针的序列如下：从5’-3’为颈环部分序列+AU+与颈环部分互补序列+与目标区域互补序列：ACGGTATTGA++AU+TCAATACCGT+与探针互补序列。在一个实施方案中，在(6)中包括对所述捕获产物测序的步骤。在第二方面，本专利技术还提供了一种拉链式探针，所述拉链式探针的3’端包括与目标DNA单链互补配对的15-20个碱基，优先选择16个碱基，5’端包括颈环结构，所述颈环结构中互补配对的碱基数目为18-50个，优选20个，所述颈环结构的环部从5’-3’方向包括A和U碱基。在一个实施方案中，拉链式探针序列从5’-3’为颈环部分序列+AU+与颈环部分互补序列+与目标区域互补序列：ACGGTATTGA++AU+TCAATACCGT+与探针互补序列。为了克服这个问题，专利技术人提出了单链转化为双链策略，然后对双链进行文库构建的方案，此方法最大的优势在于可以最大限度地保留cfDNA中原始突变信息，可以使DNA两条链中的每一条链同时被转化为用于上机测序的文库，有效地解决低频检测中遇到的瓶颈问题。附图说明通过以下附图对本专利技术进行说明图1是本申请的方法的实验流程图2示出了基因组打断与cfDNA片段中同一突变点位置分布的异同。图3单链转双链建库和双链建库比较的结果。具体实施方式图1是本申请的方法的实验流程。图2示出了基因组打断与cfDNA片段中同一突变点位置分布的异同：A图代表基因打断后n种情况下某一突变点位置在片段上的分布情况，由于在建库过程中，延伸酶都是由5’向3’端进行延伸，所以片段a片段上带有3’粘性末端会被限制性内切酶切掉，同时位于3’粘性末端的突变碱基也会被切掉，无法进入测序环节，因此无法被检测到。但是由于基因组打断的随机性，b、c、d、e等随机打断的片段上带有此突变点的信息不会被限制性内切酶切掉，因此会通过其它片段的补偿来弥补被限制性内切酶切掉的突变点信息。B图代表血浆中游离DNA片段几种情况下的同一突变点位置的分布情况。在B图中，由于片段b’片段上带有3’粘性末端会被限制性内切酶切掉，同时位于3’粘性末端的突变碱基也会被切掉，无法进入测序环节，因此无法被检测到。虽然理论上通过a’和c’片段可以检测到突变点信息，但是受制于体内酶作用与cfDNA断裂方式的有限性，b’片段的这种断裂方式可能会占比很高，另外建库过程中还会受制于酶转化效率的影响，因此有可能通过a’和c’片段的补偿，可能无法检测到突变位点信息。然而此突变位点信息可能对临床用药具有重大的指导意义，所以寻找一种可以检测到cfDNA中突变位点信息显得尤为重要。实施例1.设计一段寡核苷酸链，这条链包括：3’端有15-20个碱基与目标DNA单链互补配对，优先选择16个碱基，5’端有一段颈环结构，互补配对的碱基数目为18-50个，优选20个。在颈环的端部由5’-3’加入A和U碱基，加入A的目的是用于后续建库过程中的接头连接反应，加入U的目的是作为USEREnzyme酶切识别位点。在T4DNA连接酶的作用下，拉链式接头与变性后的单链DNA进行连接反应，连接产物在KlenowFragment的作用下进行延伸并在延伸链的3’端加上A，形成末端封闭的双链DNA复合物，在USEREnzyme酶的作用下进行剪切，转化为平末端3’带都带有A的双链DNA，用于后续的普通双链建库的连接反应中。拉链式接头序列设计如下：5’-3’方向：颈环部分序列+AU+与颈环部分互补序列+与目标区域互补序列：ACGGTATTGA++AU+TCAATACCGT+与探针互补序列(16)2.拉链式接头退火：拉链式接头变性5min之后，立即把制备有接头的管子置于冰上10min。3.转化cfDNA为单链3.1将提取后的cfDNA完全转移至PCR管中，按如下表格配置反应体系3.2使用移液器上下吹打混匀，将PCR管置于水浴锅，37℃孵育10min。3.395℃变性5min，立即转移PCR反应管至冰上，至少1min。4.连接反应4.1使用移液器上下吹打混匀，将PCR管置于室温孵育10min。4.2用QIAquickPCR纯化试剂盒对上述产物进行纯化，洗脱体积为35ul。5.延伸并加A和酶切反应5.1使用移液器上下吹打混匀，将PCR管置于水浴锅，37℃孵育30min。5.2用QIAquickPCR纯化试剂盒对上述产物进行纯化，洗脱体积为35ul。6.加带有分子标签的接头6.1接头连接HybBlock指的是封闭接头和高拷贝DNA片段的序列，封闭接头的序列为：Adapter-1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[分子标签]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAdapter-2：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[index]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG1)轻轻吸打混匀6次，避免产生气泡，然后短暂离心；2)运行PCR仪程序(要求无热盖)，设置PCR仪参数，加热模块设置20℃，时间15min。将PCR管放入PCR仪，运行程序；6.2磁珠纯化1)将AmpureXP磁珠在室温提前震荡混合均匀，室温孵育30min备用；2)在步骤3进行完的PCR管中，按照0.8X体积本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用拉链式可延伸探针的cfDNA文库构建方法，所述方法包括：(1)获得拉链式探针，所述拉链式探针的3’端包括与目标DNA单链互补配对的15‑20个碱基，优先选择16个碱基，5’端包括颈环结构，所述颈环结构中互补配对的碱基数目为18‑50个，优选20个，所述颈环结构的环部从5’‑3’方向包括A和U碱基；(2)将DNA样品打断成片段，变性成单链DNA；(3)所述拉链式探针与变性后的单链DNA进行连接反应，将连接产物进行延伸，并在延伸链的3’端加上A，形成末端封闭的双链DNA复合物；(4)将双链DNA复合物剪切，形成平末端3’都带有A的双链DNA；(5)将所述双链DNA与接头连接；(6)对连接接头的所述双链DNA进行探针捕获；(7)对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。

【技术特征摘要】
1.一种使用拉链式可延伸探针的cfDNA文库构建方法，所述方法包括：(1)获得拉链式探针，所述拉链式探针的3’端包括与目标DNA单链互补配对的15-20个碱基，优先选择16个碱基，5’端包括颈环结构，所述颈环结构中互补配对的碱基数目为18-50个，优选20个，所述颈环结构的环部从5’-3’方向包括A和U碱基；(2)将DNA样品打断成片段，变性成单链DNA；(3)所述拉链式探针与变性后的单链DNA进行连接反应，将连接产物进行延伸，并在延伸链的3’端加上A，形成末端封闭的双链DNA复合物；(4)将双链DNA复合物剪切，形成平末端3’都带有A的双链DNA；(5)将所述双链DNA与接头连接；(6)对连接接头的所述双链DNA进行探针捕获；(7)对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。2.根据权利要求1的方法，在(3)中在Klenow片段的作用下进行延伸。3.根据权利要求1的方法，在(...

【专利技术属性】
技术研发人员：余越美，蔡万世，孙永乐，
申请(专利权)人：艾吉泰康生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11