靶DNA富集探针的制备方法技术

本发明专利技术公开了靶DNA富集探针的制备方法。本发明专利技术所公开的靶DNA富集探针的制备方法包括：包括：制备N个亚探针，连接N个亚探针，得到长链DNA和/或环状DNA；将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增，得到靶DNA富集探针；N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述靶DNA的全部序列；在靶DNA上任何两个相邻的亚探针均满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠；N个亚探针的长度均为50‑150bp。实验证明，利用本发明专利技术的方法制备的靶DNA富集探针对靶DNA的捕获达到了100％覆盖，其捕获效率均达到100％，探针的整体均一性非常好，并且稳定性好，可用于靶DNA的捕获。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中，靶DNA富集探针的制备方法。
技术介绍
随着越来越多生物基因组测序的完成,生物医学研究已进入后基因组时代。随着二代测序的成本不断的降低，早在2014年，美国illumina公司已经推出全新高通量测序仪器，可以将测序成本降低到1000美元，基因检测的普及和随之加速，利用高通量测序技术在科学研究和临床检测上。目前，对于全基因组测序虽然成本已经到达1000美元，但在对于需要超高深度测序的临床或科技研究领域，特别是肿瘤检测中，高深度测序面临的测序成本以及高通量数据的处理带来的成本，不能广泛的用于临床检测及相关研究中，所以就产生了基因捕获技术，所谓基因捕获，就是针对所需要关注或研究的目的区域设计相应的捕获探针，利用杂交技术，将目的片段从全基因组中富集出来，将这些片段再进行高通量测序，既能满足研究需要深度要求，同时也能实现不增加成本，目前基因捕获技术已经在克隆、发现新基因及揭示基因功能方面具有独特的优点,已成为功能基因组时代研究的有力工具,在生物医学研究各个领域的应用日趋广泛。目前基因捕获中用到的探针为cDNA单链探针和RNA探针。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何制备可以捕获靶DNA的探针。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了靶DNA富集探针的制备方法。本专利技术所提供的靶DNA富集探针的制备方法，包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到靶DNA富集探针；所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述靶DNA的全部序列。其中，N为大于等于2的一个自然数。N的数值具体可根据所述靶DNA的长度和所述亚探针的长度确定，将所述靶DNA的长度(bp)与所述亚探针的长度(bp)的比值记为n，当n为非整数时，N＝n的整数部分+1；当n为整数时，N＝n。如果所述N个亚探针中存在序列完全相同的探针，在实际应用中还可以将去掉重复的亚探针，使所述亚探针的数量只要能满足覆盖所述靶DNA的全部序列即可。在本专利技术的一个实施例中，通过计算得到的N值为208，但在这208个亚探针中，第207个与第208个亚探针完全相同，在进行具体的实验中，可只制备第1-207条亚探针。所述N个亚探针均为单链DNA或双链DNA。所述N个亚探针能覆盖所述靶DNA的全部序列的含义为如下H1或H2：H1、当所述N个亚探针均为单链DNA时，所述N个亚探针能与所述靶DNA的两条单链DNA或一条单链DNA结合形成双链DNA；当所述N个亚探针均只与所述靶DNA的一条单链DNA结合时，该所述靶DNA的单链DNA不存在不能与所述N个亚探针中的亚探针结合的位点；当所述N个亚探针与所述靶DNA的两条单链DNA结合时，在所述靶DNA的任何一个位点均有一条链能与所述N个亚探针中的亚探针结合；也就是说，当所述N个亚探针均为单链DNA时，所述N个亚探针均与所述靶DNA的两条单链DNA或一条单链DNA互补；当所述N个亚探针只与所述靶DNA的一条链DNA互补而与所述靶DNA的另一条链DNA均不互补时，与所述N个亚探针互补的所述靶DNA的那条单链DNA中不存在不与所述N个亚探针中的亚探针互补的位点；当所述N个亚探针能与所述靶DNA的两条链中的DNA片段互补时，所述靶DNA的任何一个位点均有一条链与所述N个亚探针中的亚探针互补；H2、当所述N个亚探针均为双链DNA时，所述N个亚探针能与所述靶DNA的两条单链DNA结合形成双链DNA，所述靶DNA的两条单链DNA均不存在不能与所述N个亚探针中的任一条单链DNA结合的位点；也就是说，当所述N个亚探针均为双链DNA时，所述N个亚探针中每个亚探针的两条单链分别与所述靶DNA的两条单链DNA在同一位点互补，所述靶DNA的两条单链DNA均不存在不与所述N个亚探针互补的位点。在连接所述N个亚探针前还可包括将所述芯片上的所述N个亚探针洗脱下来。洗脱所述所述芯片上的所述N个亚探针可利用氨水进行。所述氨水的摩尔浓度可为35％。从所述芯片上洗脱下来的所述N个亚探针可利用超纯水溶解。所述制备N个亚探针可在芯片上原位合成所述N个亚探针。上述靶DNA富集探针的制备方法中，在所述靶DNA上任何两个相邻的亚探针均可满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠(即序列相同)。上述靶DNA富集探针的制备方法中，所述一个或多个核苷酸的数量可根据具体情况确定，所述一个或多个核苷酸的数量使所述N个亚探针的长度满足具体实验的要求。在本专利技术的一个实施例中，所述一个或多个核苷酸的数量使所述N个亚探针的长度均为108bp。上述方法中，所述一个或多个核苷酸的序列均为所述靶DNA上的序列，所述一个或多个核苷酸的序列为所述亚探针在所述靶DNA上延伸的序列。上述靶DNA富集探针的制备方法中，所述N个亚探针的长度均可为50-150bp。所述N个亚探针的长度具体均可为108bp。上述靶DNA富集探针的制备方法中，所述连接所述N个亚探针可包括下述A1)和A2)：A1)连接所述N个亚探针，得到长链DNA和/或环状DNA；A2)将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增，得到靶DNA富集探针。所述靶DNA富集探针为双链DNA。上述靶DNA富集探针的制备方法中，在连接所述N个亚探针前还可包括对所述N个亚探针进行磷酸化修饰。对所述N个亚探针进行磷酸化修饰具体可为在所述N个亚探针的5′端进行磷酸化修饰。所述磷酸化修饰可利用T4多聚核苷酸激酶或NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行。利用NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行所述磷酸化修饰的反应体系可为：所述N个亚探针10μl、10×反应缓冲液5μl、10mMATP5μl、T4多聚核苷酸激酶2.5μl和H2027.5μl。所述反应体系中所述N个亚探针的浓度可为5ng/μl。所述反应体系中10×反应缓冲液、ATP和T4多聚核苷酸激酶均为NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒中试剂。所述磷酸化修饰的反应条件可为37℃30min。所述连接所述N个亚探针可利用ssDNA连接酶或epicentre的ssDNA连接试剂盒(CircLigaseTMIIssDNALigase，epicentre)进行。所述连接的反应体系可为：所述N个亚探针的磷酸化产物或所述N个亚探针20μl、CircLigaseII10×ReactionBuffer5μl、50mMMnCl22.5μl、5MBetaine10μl、CircLigaseIIssDNALigase(100U)2.5μl和H2O10μl。所述连接的反应条件可为60℃60min。上述靶DNA富集探针的制备方法得步骤A2)中，在进行将所述长链DNA或所述环状DNA进行扩增时还可包括利用生物素对扩增产物进行标记。进行所述扩增可采用随机引物进行。所述随机引物可为由A、C、G和T这四个核苷酸随机组成的长度均为6bp的46条单链DNA所形成的混合物。所述随机引物中所有单链DNA的摩尔数均可相同。将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增以及利用生物素对扩增产物进行标记可利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的反应体系可为：所述长链DNA和/或所述环状DNA10μl、2×反应缓冲液25μl、Bio-16-dUTP5μl、Replig_E本文档来自技高网...

【技术保护点】
靶DNA富集探针的制备方法，包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到靶DNA富集探针；N为大于等于2的一个自然数；所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述靶DNA的全部序列。

【技术特征摘要】
1.靶DNA富集探针的制备方法，包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到靶DNA富集探针；N为大于等于2的一个自然数；所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述靶DNA的全部序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述靶DNA上任何两个相邻的亚探针均满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述N个亚探针的长度均为50-150bp。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述N个亚探针的长度均为108bp。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述连接所述N个亚探针包括下述A1)和A2)：A1)连接所述N个亚探针，得到长链DNA和/或环状DNA；A2)将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增，得到靶DNA富集探针。6.根据权利要求1-5中...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍建，林朋，
申请(专利权)人：北京迈博恒业科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11