本发明专利技术涉及分子生物学领域，公开了一种基于催产素受体分子探针的药物活性成分筛选方法，包括了构建催产素受体分子探针和建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-In T-Rex HEK293细胞系，采用荧光共振能量转移的方法建立了催产素受体分子探针，该分子探针具有高灵敏度，低噪音，高通量的特点，不仅能筛选受体激动剂也能筛选拮抗剂/反向激动剂，并且筛选过程不收下游信号的干扰；经过合理设计的分子探针能够对中药混合物进行筛选，能一步到位的在受体水平上筛选到分子作用靶点明确的先导化合物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是。
技术介绍
常规的细胞水平、动物水平的药物筛选方法不仅费时、费力，而且容易受到多重因素的干扰，假阳性、假阴性率较高，也很难确定药物作用的靶点，并且需要大量的被筛选化合物。近十年来，随着生物检测技术和计算机技术的快速发展，分子水平的药物筛选方法不断涌现，如:表面等离子体共振法、核磁共振法、下游信号分子检测法、荧光偏振法、虚拟筛选法等等，每种方法有自己的优缺点，都属于间接的筛选方法。至今还没有以受体空间构象变化为指针，可以直接、实时监测受体对药物反应的高灵敏度的筛选法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，根据受体空间构象变化为指针，可以直接、实时监测受体对药物反应的高灵敏度的筛选法。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术公开了，筛选方法包括了以下步骤:步骤I:构建催产素受体分子探针:A.采用Clontech试剂盒，将人催产素受体的cDNA连接到实验室现有载体pcDNA5/FRT/TO-VSV-G-eCFP 上，从而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-催产素受体-eCFP 质粒；B.用Clontech试剂盒将eYFP的cDNA连接到受体第三内环中部，从而得原始的分子探针质粒；C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时，以表达受体分子探针，并用市售的受体激动剂激活探针，用Olympus高速荧光显微镜监测探针的灵敏度；D.根据探针灵敏度的监测结果，对探针进行结构优化；步骤2:建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-1nT-Rex HEK293细胞系:A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-1nT-Rex HEK293细胞，并用200ug/mlHygromycin筛选阳性细胞克隆；B.用lug/ml Doxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针，用VSV抗体检测探针蛋白的表达，用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位；C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp-1nT-Rex HEK293细胞，得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线，并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。其中，步骤I中对探针进行结构优化具体如下:调整eYFP在受体第三内环的位置:将受体第三内环分别截短至两端各保留12个氨基酸，优化前探针的eYFP位于受体第三内环的中间位置，优化后探针的eYFP位于受体第三内环的238-263位置，eCFP位于受体C-末端的389位置。本专利技术具有以下有益效果:1.本专利技术采用荧光共振能量转移的方法建立了催产素受体分子探针，该分子探针具有高灵敏度，低噪音，高通量的特点，不仅能筛选受体激动剂也能筛选拮抗剂/反向激动剂，并且筛选过程不受下游信号的干扰。2.经过合理设计的分子探针能够对中药混合物进行筛选，能一步到位的在受体水平上筛选到分子作用靶点明确的先导化合物。【附图说明】图1为本专利技术分子探针的结构示意图。图2为本专利技术实施例2的结果示意图。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。实施例1如图1所示，本专利技术公开了，筛选方法包括了以下步骤:步骤I:构建催产素受体分子探针:A.采用Clontech试剂盒，将人催产素受体的cDNA连接到实验室现有载体pcDNA5/FRT/TO-VSV-G-eCFP 上，从而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-催产素受体-eCFP 质粒；B.用Clontech试剂盒将eYFP的cDNA连接到受体第三内环中部，从而得原始的分子探针质粒；C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时，以表达受体分子探针，并用市售的受体激动剂激活探针，用Olympus高速荧光显微镜监测探针的灵敏度；D.根据探针灵敏度的监测结果，对探针进行结构优化，调整eYFP在受体第三内环的位置:将受体第三内环分别截短至两端各保留12个氨基酸，优化前探针的eYFP位于受体第三内环的中间位置，优化后探针的eYFP位于受体第三内环的238-263位置，eCFP位于受体C-末端的389位置。步骤2:建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-1nT-Rex HEK293细胞系:A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-1nT-Rex HEK293细胞，并用200ug/mlHygromycin筛选阳性细胞克隆；B.用lug/ml Doxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针，用VSV抗体检测探针蛋白的表达，用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位；C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp-1nT-Rex HEK293细胞，得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线，并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。实施例2实验目的及方法:为了验证本专利技术制备分子探针的可行性和有效性，本实施例分别以生理盐水、阳性对照药物Oxytocin(OT)和酸枣仁粗提物分别研究三者对催产素受体分子探针荧光共振能量转移变化，具体的实验方法如实施例1所述，此处不再赘述。实验结果:如图2所示，将表达催产素受体分子探针的细胞置于高速荧光显微镜下，分别用生理盐水、阳性对照药物Oxytocin(OT)和酸枣仁粗提物处理细胞，监测催产素受体分子探针的荧光共振能量转移变化，实验证明催产素受体分子探针能对生理盐水并无明显反应、阳性对照药物oxytocin(OT)发生高灵敏度的反应，对酸率仁粗提物也有与阳性对照药物Oxytocin(OT)相似的反应，可以初步证明酸枣仁粗提物含有激活催产素受体分子探针的活性成分。以上所述，仅为本专利技术较佳的【具体实施方式】，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。【主权项】1.，其特征在于，所述的筛选方法包括了以下步骤: 步骤I:构建催产素受体分子探针: A.采用Clontech试剂盒，将人催产素受体的cDNA连接到实验室现有载体pcDNA5/FRT/TO-VSV-G-eCFP 上，从而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-催产素受体-eCFP 质粒； B.用Clontech试剂盒将eYFP的cDNA连接到受体第三内环中部，从而得原始的分子探针质粒； C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时，以表达受体分子探针，并用市售的受体激动剂激活探针，用Olympus高速荧光显微镜监测探针的灵敏度； D.根据探针灵敏度的监测结果，对探针进行结构优化； 步骤2:建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-1nT-Rex HEK293细胞系: A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-1nT-RexHEK293细胞，并用200ug/ml Hygromycin筛选阳性细胞克隆； B.用lug/mlDoxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针，用VSV抗体检测探针蛋白的表达，用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位； C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp-1nT-RexHEK293细胞，得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线，并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。2.如权利要求1所述的，其特本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于催产素受体分子探针的药物活性成分筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括了以下步骤：步骤1：构建催产素受体分子探针：A.采用Clontech试剂盒，将人催产素受体的cDNA连接到实验室现有载体pcDNA5/FRT/TO‑VSV‑G‑eCFP上，从而得到pcDNA5/FRT/TO‑VSV‑催产素受体‑eCFP质粒；B.用Clontech试剂盒将eYFP的cDNA连接到受体第三内环中部，从而得原始的分子探针质粒；C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时,以表达受体分子探针，并用市售的受体激动剂激活探针，用Olympus高速荧光显微镜监测探针的灵敏度；D.根据探针灵敏度的监测结果，对探针进行结构优化；步骤2：建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp‑InT‑Rex HEK293细胞系：A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp‑InT‑Rex HEK293细胞,并用200ug/ml Hygromycin筛选阳性细胞克隆；B.用1ug/ml Doxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受体分子探针，用VSV抗体检测探针蛋白的表达，用荧光显微镜监测分子探针的细胞定位；C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp‑InT‑Rex HEK293细胞，得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线，并在停止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐天瑞，刘莹，杨洋，武楠，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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