用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针、试剂盒及方法，属于分子生物学领域。本发明专利技术的分子信标探针包含Beacon MRSA 1、Beacon MRSA2和Beacon MRSA3三种探针；所述Beacon MRSA 1的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述Beacon MRSA2的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，所述Beacon MRSA3的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；所述Beacon MRSA 1、Beacon MRSA2和Beacon MRSA3的5’端均标记有荧光基团，Beacon MRSA 1、Beacon MRSA2和Beacon MRSA3的3’端均标记有猝灭基团；本发明专利技术的试剂盒含有所述分子信标探针。本发明专利技术的分子信标探针包含三条探针，这三条探针联合作用，提高了检测的荧光信号强度，并且特异性高，可以灵敏、有效、快速地检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；同时，本发明专利技术建立了检测MRSA的反应体系及检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针、试剂盒及方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
金黄色葡萄球菌(Staphalococcusaureus)属革兰阳性球菌，微球菌科，葡萄球菌属。它能引起化脓性炎症，当细菌侵入血液时，可引起致病性败血症。自从上世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制，但随着青霉素的广泛使用，有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解β-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药。为此科学家研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(methicillin)。1959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感染，但随后1961年就发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，MRSA从发现至今感染几乎遍及全球，已成为院内和社区感染的重要病原菌之一。自从1961年英国发现MRSA后，在欧美及亚洲一些国家相继报道了MRSA所致的院内感染。从60年代后期到80年代，MRSA感染率大大增加。美国NNIS报道1975年182所医院MRSA占金黄色葡萄球菌感染总数的2.4％，1991年上升至24.8％，其中尤以500张床以上的教学医院和中心医院为多，因为这些医院里MRSA感染的机会较多，耐药菌株既可由感染病人带入医院，也可因滥用抗生素在医院内产生。欧洲1993年1417家医院ICU分离的MRSA达60％。而日本Kansai医科大学附属医院MRSA的分离率1993年达到41％。国内在70年代发现有MRSA，近几年MRSA的检出率正在逐年上升，上海1978年在200株金黄色葡萄球菌中MRSA只占5％，1988年上升至24％，1996年激增至72％。MRSA感染多发生于免疫缺陷者，大面积烧伤，大手术后患者，长期住院及老年患者，MRSA极易导致感染的流行和暴发。为有效控制MRSA的感染，以及降低疾病造成的危害，建立准确，快速的检测方法是首要任务。目前临床上检测MRSA常用的方法有细菌培养法和PCR法。其中细菌培养法是检测MRSA的金标准，但该方法需要进行药敏实验，通常需要3-5天才能看到最终的检测结果，检测成本高、检测周期长；利用PCR方法可在短时间内使特定的核酸序列拷贝数几何级数增加，有很高的灵敏度和特异性，但缺点是假阳性率高，另一方面，患者血液中有往往含有抑制PCR反应的成分，这又会导致假阴性的出现，这两方面的缺点限制了PCR检测的临床应用。目前，已有用荧光原位杂交(FISH)检测MRSA的报道，但均采用的是线形探针，该方法的缺点是，杂交完成后，必须用严格的洗涤条件来除去未杂交的探针，而且经常会因为探针清洗不完全而造成假阳性。由此可见，MRSA感染的临床诊断，急需更简洁、灵敏的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种荧光信号强度高、特异性好、可有效、快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子信标探针。同时，本专利技术还提供了一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒及方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针，其包含BeaconMRSA1、BeaconMRSA2和BeaconMRSA3三种探针；所述BeaconMRSA1的碱基序列如SEQIDNO:1所示，所述BeaconMRSA2的碱基序列如SEQIDNO:2所示，所述BeaconMRSA3的碱基序列如SEQIDNO:3所示；所述BeaconMRSA1、BeaconMRSA2和BeaconMRSA3的5’端均标记有荧光基团，BeaconMRSA1、BeaconMRSA2和BeaconMRSA3的3’端均标记有猝灭基团。本申请专利技术人通过对比大量MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和MSSA(甲氧西林非耐药金黄色葡萄球菌)菌株的基因序列，挑选出MRSA特有的基因mecA作为检测靶点，并针对该靶点、在该段靶序列上根据热力学特征和高级结构，设计、合成三条探针(BeaconMRSA1,BeaconMRSA2和BeaconMRSA3)。这三条探针联合作用，提高了检测的荧光信号强度，并且特异性高，可以灵敏、有效、快速地检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。本专利技术的分子信标探针中，各探针5’端的茎序列为：5’-TTCCA-3’，3’端的茎序列为：5’-TGGAA-3’，各探针5’端的茎序列与3’端的茎序列互补，使得探针可以形成颈环结构，且不会与探针本身形成高级结构。但茎序列并不限于本专利技术所述序列，本领域的技术人员可根据现有技术选择其他合适的茎序列。本专利技术的分子信标探针用于检测的样本范围广泛，包括血液、体液、脓液、尿液、组织切片、食物样本和来自土壤、空气和水的样本，以及它们的培养物等。这些样本经相应处理后，只要保持细胞形态完整并且靶核酸未被破坏，均可使用本专利技术的分子信标探针检测。作为本专利技术所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针的优选实施方式，所述荧光基团为CY3，猝灭基团为BHQ1或者所述荧光基团为FAM，猝灭基团为TANRA。本专利技术探针的5’端用CY3标记，3’端用BHQ1标记时，荧光基团的激发波长为552nm，检测波长为570nm。当然，本专利技术分子信标探针的5’端还可以用其他荧光基团标记，例如FITC等，其3’端也可选择其他猝灭基团标记，例如BDH或TANRA等，荧光基团或荧光猝灭基团可以根据现有技术进行添加。另外，本专利技术还提供了含有上述分子信标探针的用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒。作为本专利技术所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括杂交液和洗涤液。作为本专利技术所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的优选实施方式，所述杂交液含有硫酸葡聚糖、NaCl、去离子甲酰胺、Na2EDTA、TritonX-100和Tris-HCl缓冲溶液；所述洗涤液含有Tris、NaCl、TritonX-100和十二烷基硫酸钠，洗涤液的pH值为6～10。作为本专利技术所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的更优选实施方式，所述去离子甲酰胺的浓度为10～40％(v/v)。进一步地，所述杂交液含有以下组分：1～10％(w/v)硫酸葡聚糖，100～1000mmol/LNaCl，10～40％(v/v)去离子甲酰胺，5mmol/LNa2EDTA，0.01～1％(v/v)TritonX-100和5～200mMTris-HCl缓冲溶液,Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.5；所述洗涤液含有以下组分：5～50mmol/LTris，10～1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针，其特征在于：所述分子信标探针包含Beacon MRSA1、Beacon MRSA2和Beacon MRSA3三种探针；所述Beacon MRSA1的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述Beacon MRSA2的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，所述Beacon MRSA3的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；所述Beacon MRSA1、Beacon MRSA2和Beacon MRSA3的5’端均标记有荧光基团，Beacon MRSA1、Beacon MRSA2和Beacon MRSA3的3’端均标记有猝灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针，其特征在于：所述分子
信标探针包含BeaconMRSA1、BeaconMRSA2和BeaconMRSA3三种探针；所述BeaconMRSA1
的碱基序列如SEQIDNO:1所示，所述BeaconMRSA2的碱基序列如SEQIDNO:2所示，所述
BeaconMRSA3的碱基序列如SEQIDNO:3所示；所述BeaconMRSA1、BeaconMRSA2和Beacon
MRSA3的5’端均标记有荧光基团，BeaconMRSA1、BeaconMRSA2和BeaconMRSA3的3’端均标
记有猝灭基团。
2.如权利要求1所述的用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针，其特征
在于：所述荧光基团为CY3，猝灭基团为BHQ1或者所述荧光基团为FAM，猝灭基团为TANRA。
3.一种含有如权利要求1或2所述分子信标探针的用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检
测的试剂盒。
4.如权利要求3所述的用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒，其特征在于：所
述试剂盒还包括杂交液和洗涤液。
5.如权利要求4所述的用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒，其特征在于：所
述杂交液含有硫酸葡聚糖、NaCl、去离子甲酰胺、Na2EDTA、TritonX-100和Tris-HCl缓冲溶
液；所述洗涤液含有Tris、NaCl、TritonX-100和十二烷基硫酸钠，洗涤液的pH值为6～10。
6.如权利要求5所述的用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒，其特征在于：所
述去离子甲酰胺的浓度为10...

【专利技术属性】
技术研发人员：方国伟，洪冉，
申请(专利权)人：苏州达麦迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32