一种快速检测HER‑2基因扩增的探针组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种使用荧光原位杂交技术快速检测HER‑2基因扩增的方法，每个靶位点的检测需要三种探针，分别为：接触探针、扩增探针和荧光探针。其中接触探针的5’端特异性地与HER‑2基因结合，3’端有20组20碱基的重复序列，可以特异性地与扩增探针相结合；扩增探针的5’端特异性地与接触探针的3’端结合，3’端有20组20碱基的重复序列，可以特异性地与荧光探针结合；荧光探针的5’末端带有CY3或FITC标记，通过这三种探针的协同作用，将荧光信号放大400倍，实现HER‑2基因扩增快速、灵敏的检测。本发明专利技术还公开了一种快速检测HER‑2基因扩增的试剂盒及探针组。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测HER-2基因扩增的探针组、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学领域，特别涉及一种探针组和试剂盒，通过使用荧光原位杂交的手段，快速检测样品中的HER-2基因扩增。
技术介绍
HER-2/neu基因(Her-2基因)在20-30％的浸润性乳腺癌中存在扩增，常见的扩增有单纯的Her-2基因扩增，也存在17号染色体非整倍性导致的Her-2基因拷贝数增加。Her-2基因所编码的蛋白为表皮生长因子受体蛋白2，其家族中共有4位成员，分别位Her1、Her2、Her3和Her4，属于酪氨酸激酶受体家族。基础研究显示，这些受体通过同源二聚或异源二聚的方式发生偶联，使受体胞内部分的酪氨酸激酶激活，导致下游的蛋白发生磷酸化，从而发挥调控细胞增殖以及血管生成等作用。正确的判断Her-2基因状态，可以准确的判断患者预后，并能指导临床合理选择治疗药物。HER-2基因扩增的患者能明显受益于靶向治疗药物赫赛汀。在该药物的临床应用过程中，HER-2基因的检测是至关重要的，因为该药物对具有HER-2基因扩增的患者具有良好的治疗效果，而对于低度扩增或者是不扩增的患者疗效不理想。由于上述原因，HER-2基因扩增被列入乳腺癌临床必检项目，目前临床上检测HER-2扩增的常见方法有免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)，其中FISH是检测HER-2扩增的金标准。但传统FISH使用的是基因组探针，探针总长度达100Kb以上，由于探针长度极长，覆盖范围极大，使得部分序列不可避免地出现非特异性杂交，导致背景偏高；同时，过长的探针也经常导致荧光信号点发散，不利于信号的确认和统计。由于传统FISH探针单位长度的荧光强度有限，用减少探针长度的方法来解决上述问题，会使得荧光信号强度降低，不利于检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种探针组，通过荧光原位杂交的手段，建立一种快速、灵敏、特异性地检测样品中HER-2基因扩增的方法。本专利技术的快速检测HER-2基因扩增的方法与传统FISH方法相比，具有背景低，信号点集中，特异性强，速度快等优点，能快速、高效地检测HER-2基因扩增。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种快速检测HER-2基因扩增的探针组，所述探针组由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成，所述接触探针包括接触探针1和接触探针2，所述扩增探针包括扩增探针1和扩增探针2，所述荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2，其中，接触探针1、扩增探针1、荧光探针1、接触探针2、扩增探针2和荧光探针2的碱基序列分别为：接触探针1：5’-GTGGCGCTTAAGAAAATCCGCCTGGACACT(GTATJCGCJCTGFTATJCCG)-3’；扩增探针1：5’-CGGFATAJCAGFGCGFATAC(TCFACGJCFCTAJGGAFAAFG)-3’；荧光探针1：5’-CY3-JTTJTCCFTAGJGFCGTJGA-3’；接触探针2：5’-CCTCGGAGAGGACAGAGGCCTAGGCCCACG(AGTFAJCGCFGTAFCAAJTJ)-3’；扩增探针2：5’-FAFTTGJTACJGCGFTJACT(GCAFJTTACCGFAJJTACFT)-3’；荧光探针2：5’-FITC-AJGTAFFTJCGGTAAFJTGC-3’。优选地，所述荧光探针1和所述荧光探针2的5’端用荧光基团标记。优选地，所述荧光基团为CY3或FITC。进一步地，所述接触探针1、所述扩增探针1和所述荧光探针1用于检测HER-2基因，所述荧光探针1将HER-2基因标记为红色荧光，所述接触探针2、所述扩增探针2和所述荧光探针2用于检测17号染色体的着丝粒，所述荧光探针2将17号染色体的着丝粒标记为绿色荧光，所述接触探针、所述扩增探针和所述荧光探针的碱基序列中的F表示甲基化的C，J表示甲基化的G，引入F/J两种天然基因组DNA中不存在的碱基，可以有效地减少非特异性杂交，提高检测的特异性。本专利技术还提供了一种用于快速检测HER-2基因扩增的的试剂盒，所述试剂盒包括杂交液和上述由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成的探针组。进一步地，所述杂交液包括：1～10％(w/v)硫酸葡聚糖，100～1000mMNaCl，10～40％(v/v)去离子甲酰胺，5mMNa2EDTA，0.01～1％(v/v)TritonX-100，5～200mMTris-HCl(pH7.5)，0.1～1％的吐温80，0.1～1％的三甲铵乙内酯。本专利技术最后提供了一种上述试剂盒快速检测HER-2基因扩增的方法，包括如下步骤：(1)吸取10μL样本滴在载玻片上，在56℃下烘干，使样本固定在载玻片上；(2)在室温下将载玻片浸入二甲苯中脱蜡2次，每次10min，随后在100％乙醇中浸泡5min，接着依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min复水，在90℃下浸入纯化水中煮20-30min，每5min将样本玻片取出观察一次，防止样本脱落，取出载玻片，在室温下将其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脱水，自然晾干；(3)分别吸取0.5μL的接触探针1、接触探针2、扩增探针1、扩增探针2、荧光探针1和荧光探针2，加入到17μL杂交缓冲液中，混匀，离心，得到探针混合物；(4)将20μL探针混合物滴于载玻片的杂交区域，盖片，胶水封边，置于杂交仪中杂交30min；(5)去除载玻片上的封片胶和盖玻片，在67±1℃下干燥2h，然后将其浸入含0.3％(v/v)NP-40的0.4×SSC溶液中漂洗2min，其间晃动1～2次，在暗处自然晾干；(6)将10μLDAPI复染剂滴于载玻片的杂交区域，加盖盖玻片，静置10min，用荧光显微镜镜检。本专利技术的技术要点或原理：荧光原位杂交(FlourescenceinsituHybridization，FISH)是一种应用标记有荧光物质的探针，通过杂交的方法来检测细胞或组织内特异性DNA或RNA的方法；传统的荧光原位杂交由于单条探针的荧光强度有限，只能通过用多条探针共同作用的方法来提高荧光信号强度，这些探针单条长度约200～500bp，覆盖总计高达100Kb以上的基因组区域。由于探针数量多，覆盖范围广，不可避免的有部分探针会产生非特异性杂交，从而导致背景上升。同时，由于探针的覆盖范围过大，很多时候荧光信号不能精确地聚成一个点，而是会发散开来，影响检测和结果判读，此外，传统FISH检测需经历长达16小时的杂交，检测时间长，检测效率低。本专利技术通过引入接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针，并通过这三种探针与靶基因(HER-2)的相互作用，将荧光信号放大400倍，且杂交时间仅需要30分钟；本专利技术通过在三种探针中引入F(甲基化的C)和J(甲基化的G)两种天然DNA中不存在的碱基，来提高三种探针相互作用的精度，有效地避免非特异性杂交。本专利技术通过大量实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为42-58℃，甲酰胺最佳浓度为10-40％，分子信标的最佳浓度为10ng/L。本专利技术荧光探针5’端的荧光基团，包括但不限于FITC或Cy3，可以根据现有技术进行添加。与传统荧光原位杂交方法相比，本专利技术提供的方法具有以下优点：1、本专利技术的探针组特异性地识别HER-2基因上30bp的序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测HER‑2基因扩增的探针组，其特征在于，由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成，所述接触探针包括接触探针1和接触探针2，所述扩增探针包括扩增探针1和扩增探针2，所述荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2，其中，接触探针1、扩增探针1、荧光探针1、接触探针2、扩增探针2和荧光探针2的碱基序列分别为：接触探针1：5’‑GTGGCGCTTAAGAAAATCCGCCTGGACACT(GTATJCGCJCTGFTATJCCG)‑3’；扩增探针1：5’‑CGGFATAJCAGFGCGFATAC(TCFACGJCFCTAJGGAFAAFG)‑3’；荧光探针1：5’‑CY3‑JTTJTCCFTAGJGFCGTJGA‑3’；接触探针2：5’‑CCTCGGAGAGGACAGAGGCCTAGGCCCACG(AGTFAJCGCFGTAFCAAJTJ)‑3’；扩增探针2：5’‑FAFTTGJTACJGCGFTJACT(GCAFJTTACCGFAJJTACFT)‑3’；荧光探针2：5’‑FITC‑AJGTAFFTJCGGTAAFJTGC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测HER-2基因扩增的探针组，其特征在于，由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成，所述接触探针包括接触探针1和接触探针2，所述扩增探针包括扩增探针1和扩增探针2，所述荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2，其中，接触探针1、扩增探针1、荧光探针1、接触探针2、扩增探针2和荧光探针2的碱基序列分别为：接触探针1：5’-GTGGCGCTTAAGAAAATCCGCCTGGACACT(GTATJCGCJCTGFTATJCCG)-3’；扩增探针1：5’-CGGFATAJCAGFGCGFATAC(TCFACGJCFCTAJGGAFAAFG)-3’；荧光探针1：5’-CY3-JTTJTCCFTAGJGFCGTJGA-3’；接触探针2：5’-CCTCGGAGAGGACAGAGGCCTAGGCCCACG(AGTFAJCGCFGTAFCAAJTJ)-3’；扩增探针2：5’-FAFTTGJTACJGCGFTJACT(GCAFJTTACCGFAJJTACFT)-3’；荧光探针2：5’-FITC-AJGTAFFTJCGGTAAFJTGC-3’。2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述荧光探针1和所述荧光探针2的5’端用荧光基团标记。3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述荧光基团为CY3或FITC。4.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述接触探针1、所述扩增探针1和所述荧光探针1用于检测HER-2基因，所述荧光探针1将HER-2基因标记为红色荧光，所述接触探针2、所述扩增探针2和所述荧光探针2用于检测17号染色体的着丝粒，所述荧光探针2将17号染色体的着丝粒标记为绿色荧光。5.根据权利要求4所述的探针组，其特征在于，所述接触探针、所述扩增探针和所述荧光探针的碱基序列中的F和J为两种天然基因组DNA中不存在的...

【专利技术属性】
技术研发人员：方国伟，洪冉，
申请(专利权)人：苏州达麦迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32