一种龙眼快速转基因方法技术

本发明专利技术提供了龙眼快速转基因方法，属于转基因植物制备领域。它包括龙眼实生幼苗的准备，转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备，实生幼苗去顶芽或去顶（切除带叶的上部）材料的制备、侵染和共培养，抗性芽的筛选与培养，再生抗性芽的分子生物学鉴定，转基因植株的移植。完全不依赖植物组织培养，以直播的实生幼苗的去顶芽和去顶材料进行侵染，获得转基因植株；不需培育无菌试管苗、胚状体和悬浮细胞，转基因抗性芽不需继代转接，成活率高，在温室中进行不受气候与环境影响，周年可进行转化。本方法操作步骤简便、成本降低、时间更短。

Method for rapidly changing longan

The invention provides a method for rapid transformation of longan, which belongs to the field of transgenic plant preparation. It includes the Longan Seedlings to vector and transformed into Agrobacterium infection solution preparation, seedling bud or to go to the top (upper leaf excision), infection and co cultivation materials, screening and culturing of resistant buds, molecular identification of resistant Buds Regeneration of transgenic plants transplantation. Completely independent of plant tissue culture, to live the seedlings to bud and to the top material for infection, to obtain transgenic plants; no germfree plantlets, embryoid and suspension cells of transgenic resistant buds without subculture transfer, high survival rate, were not affected by climate and environmental factors in the greenhouse anniversary, can be converted. The method has the advantages of simple operation, low cost and shorter time.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及龙眼的快速转基因方法，属于转基因植物制备领域，主要应用于龙眼的种质资源创新。
技术介绍
龙眼种质创新所应用的转基因方法的研究较少，实验室主要用根癌农杆菌介导的转化法、基因枪转化法，所用的外植体有胚状体、愈伤组织的悬浮细胞系，以根癌农杆菌介导的转化法、基因枪转化法，利用胚状体、愈伤组织的悬浮细胞系为外植体需无菌培养，周期长，成本也高，目前也只得到转化的胚状体，这两种方法并未得到龙眼转基因植株。曾黎辉等采用发根农杆菌介导法，侵染龙眼的胚状体和无菌试管苗，对产生的96条发状根进行培养，只有3条毛状根经体胚发生途径产生胚状体，然后再分化成小植株，得到3个转基因株系，阳性率3.125%，与正常龙眼植株相比，转化植株表现出叶片薄和变小、生长缓慢、卷成茎的形状等异常现象。研究表明发根农杆菌介导法的缺点为转基因植株会表现出顶端优势丧失、叶片皱缩、节间缩短和花形改变等异常现象；此方法还过度依赖植物组织培养，获得胚状体或转化植株的周期长，成本高，转化效率低，后期还需要进行炼苗与移栽等过程，转基因植株容易由此过程造成死亡。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供龙眼快速转基因方法，完全不依赖植物组织培养，以直播的实生幼苗的去顶芽和去顶材料进行侵染，获得转基因植株；不需培育无菌试管苗、胚状体和悬浮细胞，转基因抗性芽不需继代转接，成活率高，在温室中进行不受气候与环境影响，周年可进行转化。本方法操作步骤简便、成本降低、时间更短。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种龙眼快速转基因方法，包括以下步骤：(1)龙眼直播实生幼苗的准备；(2)转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备；(3)实生幼苗去顶芽和去顶（切除带叶的上部）材料的制备、侵染和共培养；(4)去顶芽和去顶幼苗的抗性芽筛选与培养；(5)再生抗性芽的分子生物学鉴定；(6)转基因植株的移植。不依赖植物组织培养，以穴盘直播的实生幼苗的去顶芽和去顶材料快速获得转基因植株的方法。具体方法为：步骤(1)龙眼直播实生幼苗准备方法为：取8成熟以上的龙眼，剥去果皮与果肉，选健康饱满的种子，用清水洗种子后直播于穴盘的营养土中，每穴播1粒种子，25℃温室中暗培养1周，待种子萌发出土后，转移至25℃温室中光照培养2周，至4片真叶期。步骤(2)转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备方法为：将携带pCAMBIA1301、pCAMBIA1301-MFT、pCAMBIA1301-MFT-RNAi载体的根癌农杆菌菌液，在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的25mlYEB液体培养基上，28℃、200rpm/min暗培养至OD600为0.4-0.8，4000rpm/min离心10min收集菌体，并重悬于无抗生素、含有100μM的乙酰丁香酮和10mmol/LMgCl2的25mlMS液体培养基中，28℃振荡培养2小时后调OD600至0.4-1.0，用于侵染。步骤(2)pCAMBIA1301-MFT载体制备方法：在MFT基因开放阅读框两端设计特异引物MFT-F：ATTCTCTAGAATGGCGGCTTCGGTGGATC,下划线为XbaI酶切位点，MFT-R：GGGGTACCTTAGCGGCGACGGTTGGCC，下划线为KpnI酶切位点，扩增MFT基因并进行TA克隆、测序，XbaI和KpnI双酶切TA克隆质粒与pSPROK载体后将MFT连接到pSPROK载体上，获得pSPROK-MFT，将pSPROK-MFT和pCAMBIA1301用HindIII与EcoRI双酶切后，将pSPROK-MFT双酶切产物35S-MFT-NOS连接到pCAMBIA1301上，构建pCAMBIA1301-MFT表达载体。pCAMBIA1301-MFT-RNAi载体制备方法：根据MFT基因序列，设计二对方向相反的引物，扩增RNAi正反向插入片段。正向片段引物MFT(+)-F:ATTCTCTAGAAGTGGTGGGTCGGGTTATT，MFT(+)-R:ATTCTCTAGACGGTTCCTTCTGAGCATTG，下划线为XbaI酶切位点；反向片段引物MFT(-)-F:TATAGCGGCCGCAGTGGTGGGTCGGGTTATT，下划线为NotI酶切位点，MFT(-)-R:TATAGCGGCCGCCGGTTCCTTCTGAGCATTG，下划线为BamHI酶切位点；正反向片段TA克隆、测序验证后用相应的限制性内切酶切下，连接到pJM007干扰载体上，构建pJM007-MFT-RNAi载体；用PstI酶切pJM007-MFT-RNAi，回收小片段后，用CIAP进行去磷酸化，用PstI酶切pCAMBIA1301后，将去磷酸化片段连接到pCAMBIA1301上，构建pCAMBIA1301-MFT-RNAi表达载体。步骤(3)实生幼苗去顶芽材料制备、侵染方法为：将4片真叶期幼苗的顶芽去掉保留真叶，用棉花吸取OD600为0.4-1.0的根癌农杆菌菌液后，用摄子将带菌液的棉花紧贴在去顶芽的位置侵染20min后，用新的带侵染菌液棉花再次侵染20min，弃带侵染菌液棉花，将吸有无菌水的棉花贴在去顶芽处保湿，在28℃下暗培养4天。或步骤(3)实生幼苗去顶材料制备、侵染方法为：将4片真叶期实生幼苗去顶即切除带叶的上部，茎部保留1.5cm-3.5cm，用可拉伸的封口膜或保鲜膜在茎部的切口处缠绕成一小塑料杯形，将OD600为0.4-1.0的根癌农杆菌菌液用移液器转移60ul至小塑料杯形内，在切口处侵染20min，用棉花吸干后再重复侵染20min，用棉花吸干，将封口膜或保鲜膜封住切口保湿，在28℃下暗培养4天。步骤(4)去顶芽幼苗的抗性芽筛选与培养方法为：暗培养4天后，弃保湿的棉花，用吸有60mg/L的潮霉素溶液的棉花擦拭去顶芽处2次，然后把带有60mg/L的潮霉素溶液的棉花贴在去顶芽处以筛选抗性芽，25℃下暗培养2-3周，当伤口处长出抗性芽时转移到25℃下光照培养。或者步骤(4)所述的去顶外植体的抗性芽的筛选与培养方法为：暗培养4天后，将封口膜或保鲜膜打开，用棉签吸60mg/L的潮霉素溶液后擦拭切口2次，并在切口处留下1滴潮霉素溶液，再将封口膜或保鲜膜包紧以筛选抗性芽，25℃下暗培养2-3周，当伤口处长出抗性芽时转移到25℃下光照培养。步骤(5)再生抗性芽的分子生物学鉴定方法为：抗性芽长有2片叶以上时，取0.1g叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，以pCAMBIA1301载体GUS标记基因引物GUS-F:ACGTCCTGTAGAAACCCCAACC；GUS-R:TCCCGGCAATAACATACGGCGT；扩增片段375bp，进行PCR检测；再以载体与目的基因的特异扩增片段的引物p-MFT-i-F:GATGACGCACAATCCCACT；p-MFT-i-R:GGTAGAAGCAGAAACTTACGGA；扩增片段678bp，进行PCR进一步的检测验证，以未转化的再生植株DNA为阴性对照，转化用质粒为阳性对照；抗性芽的扩增产物回收、TA克隆和测序验证。...

【技术保护点】
一种龙眼快速转基因方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)龙眼直播实生幼苗的准备；(2)转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备； (3)实生幼苗去顶芽和去顶、切除带叶的上部材料的制备、侵染和共培养； (4)去顶芽和去顶幼苗的抗性芽筛选与培养；(5)再生抗性芽的分子生物学鉴定；(6)转基因植株的移植。

【技术特征摘要】
1.一种龙眼快速转基因方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)龙眼直播实生幼苗的准备；
(2)转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备；
(3)实生幼苗去顶芽和去顶、切除带叶的上部材料的制备、侵染和共培养；
(4)去顶芽和去顶幼苗的抗性芽筛选与培养；
(5)再生抗性芽的分子生物学鉴定；
(6)转基因植株的移植。
2.根据权利要求1所述的一种龙眼快速转基因方法，其特征在于，步骤(1)所述的龙眼直播实生幼苗准备方法为：取8成熟以上的龙眼，剥去果皮与果肉，选健康饱满的种子，用清水洗种子后直播于穴盘的营养土中，每穴播1粒种子，25℃温室中暗培养1周，待种子萌发出土后，转移至25℃温室中光照培养2周，至4片真叶期。
3.根据权利要求1所述的一种龙眼快速转基因方法，其特征在于，步骤(2)所述的转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备方法为：将携带pCAMBIA1301、pCAMBIA1301-MFT、pCAMBIA1301-MFT-RNAi载体的根癌农杆菌菌液，在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的25mlYEB液体培养基上，28℃、200rpm/min暗培养至OD600为0.4-0.8，4000rpm/min离心10min收集菌体，并重悬于无抗生素、含有100μM的乙酰丁香酮和10mmol/LMgCl2的25mlMS液体培养基中，28℃振荡培养2小时后调OD600至0.4-1.0，用于侵染；pCAMBIA1301-MFT载体制备方法：在MFT基因开放阅读框两端设计特异引物MFT-F：ATTCTCTAGAATGGCGGCTTCGGTGGATC，MFT-R：GGGGTACCTTAGCGGCGACGGTTGGCC，扩增MFT基因并进行TA克隆、测序，XbaI和KpnI双酶切TA克隆质粒与pSPROK质粒载体后将MFT基因连接到pSPROK载体上，获得pSPROK-MFT，将pSPROK-MFT和pCAMBIA1301用HindIII与EcoRI双酶切后，将pSPROK-MFT双酶切产物35S-MFT-NOS连接到pCAMBIA1301上，构建pCAMBIA1301-MFT表达载体；pCAMBIA1301-MFT-RNAi载体制备方法：根据MFT基因序列，设计二对方向相反的引物，扩增RNAi正反向插入片段,正向片段引物MFT(+)-F:ATTCTCTAGAAGTGGTGGGTCGGGTTATT，MFT(+)-R:ATTCTCTAGACGGTTCCTTCTGAGCATTG，下划线为XbaI酶切位点；反向片段引物MFT(-)-F:TATAGCGGCCGCAGTGGTGGGTCGGGTTATT，下划线为NotI酶切位点，MFT(-)-R:TATAGCGGCCGCCGGTTCCTTCTGAGCATTG，下划线为BamHI酶切位点；正反向片段TA克隆、测序验证后用相应的限制性内切酶切下，连接到pJM007干扰载体上，构建pJM007-MFT-RNAi载体；用PstI酶切pJM007-MFT-RNAi，回收小片段后，用CIAP进行去磷酸化，用PstI酶切pCAMBIA1301后，将去磷酸化片段连接到pCAMBIA1301上...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈裕坤，程春振，赖钟雄，林玉玲，刘生财，张梓浩，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35