RT‑LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种RT‑LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物和试剂盒，该引物组合物的设计合理，特异性强；含有该引物组合物的试剂盒特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉眼观察扩增结果；本发明专利技术还提供一种RT‑LAMP检测结核分枝杆菌活菌的检测方法，该方法简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增反应快，节省时间，扩增结果通过肉眼即可观察，能特异性检测死菌或活菌。本发明专利技术适用于检测结核分枝杆菌活菌。

【技术实现步骤摘要】
RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法
本专利技术属于分子检测
，涉及一种引物组合物、试剂盒和检测方法，具体地说是一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌引起的严重影响人类健康的慢性传染病，是至今仍然困扰人类的古老疾病之一，在古埃及木乃伊中就已发现结核分枝杆菌的存在，即使在最近几年,每年还大约有900万人感染结核。随着耐药与多重耐药菌株的出现，结核病的控制难度不断增加，而建立快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法，对于结核病的防治工作具有重要意义，也是进行早期隔离、诊治的前提。目前，结核病的诊断方法主要是痰涂片抗酸染色法、罗氏固体培养法、液体快速培养、核酸扩增等方法。染色涂片虽然简单易行，但敏感性差，检出率低，并且不能鉴别是死菌还是活菌，亦不能分辨结核分支杆菌与非结核分枝杆菌；罗氏固体培养法培养周期长，需要4-8周，改进后液体快速培养系统将时间缩短到10天左右，但花费昂贵且容易受到污染，只能检出活力旺盛的菌，并且培养法不能鉴别结核分支杆菌与非结核分枝杆菌；以扩增核酸为基础的实验技术，具有快速、灵敏、特异强等特点，比如PCR、LAMP等；但因PCR技术对操作人员技能有较高要求，需要的热循环设备格昂贵而很难得到推广，环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）克服了上述缺点，具有反应快速、操作简单的优势，一台水浴锅等恒温设备即可完成操作，扩增结果可用肉眼判定，对员工简单培训即可完成操作，适合在基层医疗机构应用，但PCR、LAMP等分子生物学检测法是针对结核杆菌DNA基因为靶序列设计的引物并进行扩增的，对死菌或活菌都呈现阳性结果，无法在临床上评估抗结核治疗效果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题，是要提供一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物及相应的试剂盒，该引物组合物的序列设计合理，特异性强，灵敏度高；含有该引物组合物的试剂盒特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉眼观察扩增结果；本专利技术的另外一个目的，是提供一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的方法，该方法简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增反应快，节省时间，30min内即可完成扩增，扩增结果通过肉眼即可观察，能特异性检测死菌或活菌。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物，它包括：正向外引物F3：5’-TCCTGGCTCAGGACGAAC-3’；反向外引物B3：5’-CGCTTTCCACCACAAGACAT-3’；正向内引物FIP：5’-TCGCCACTCGAGTATCTCCGAAGCGGCGTGCTTAACACAT-3’；反向内引物BIP：5’-AGTAACACGTGGGTGATCTGCCATCCCGTGGTCCTATCCG-3’；反向环引物LB：5，-ATAAGCCTGGGAAACTGGGT-3，本专利技术提供了一种用于检测结核分枝杆菌活菌的RT-LAMP试剂盒，包括25μL的RT-LAMP扩增反应液，所述RT-LAMP扩增反应液包括如下组分：0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.8μM反向环引物LB、0.8M甜菜碱、8mMMgSO4、1.4mMdNTPs，8UBstDNA聚合酶、20U重组核糖核酸酶抑制剂、100UM-MLV反转录酶、2.5μL10×buffer、1μL模板RNA、5mM/μL钙黄绿素、10mM/μLMnCl2混合液、11.7μL去离子水。本专利技术还提供了一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的方法，利用前述的试剂盒进行检测，并按照如下的步骤顺序进行：（1）在反应管中加入0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.8μM反向环引物LB、0.8M甜菜碱、8mMMgSO4、1.4mMdNTPs，8UBstDNA聚合酶、20U重组核糖核酸酶抑制剂、100UM-MLV反转录酶、2.5μL10×buffer、1μL模板RNA、5mM/μL钙黄绿素、10mM/μLMnCl2和11.7μL去离子水，并将反应管置于恒温水浴箱内反应；（2）将步骤（1）的反应管置于90℃恒温水浴箱内2min，终止反应，根据反应管中液体的颜色变化判断扩增结果。作为限定，所述恒温水浴箱的温度为60-65℃，反应时间为30-50min。作为进一步限定，所述恒温水浴箱的温度为60℃，反应时间为50min。由于采用了上述的技术方案，本专利技术与现有技术相比，所取得的技术进步在于：本专利技术提供的用于检测结核分枝杆菌活菌的RT-LAMP的引物组合物设计合理，特异性强；含有该引物组合物的试剂盒特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉眼观察扩增结果；结核杆菌16SrRNA半衰期短，仅存在于代谢增殖的活菌中，占总RNA的80%，与DNA的单一拷贝相比较，16SrRNA拷贝数更多，本专利技术提供的用于检测结核分枝杆菌活菌的检测方法，选择能合并反转录功能的RT-LAMP方法，不仅有助于判定活菌，而且可以进一步提高灵敏性；检测方法简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增反应快，节省时间，30min内即可完成扩增，扩增结果通过肉眼即可观察，能特异性检测死菌或活菌。本专利技术适用于对结核杆菌的活菌进行检测。本专利技术下面将结合具体实施例作进一步详细说明。附图说明图1为RT-LAMP引物的相对位置和特异识别位点图；图2为不同温度的RT-LAMP与LAMP电泳图（A图和B图中：M-250bpDNAmaker；1-56℃、2-58℃、3-60℃、4-63℃；5-65℃；6-阴性对照）；图3为RT-LAMP与LAMP检测时效对比图（A-不同时间的RT-LAMP电泳图；B-不同时间的LAMP电泳图；图中：M-250bpDNAmaker；1-20min、2-25min、3-30min、4-40min、5-50min；6-阴性对照）；图4为RT-LAMP和LAMP的灵敏度实验结果图（A-RT-LAMP凝胶电泳及钙黄绿素染色图；B-LAMP凝胶电泳及钙黄绿素染色图；A图和B图中：M-250bpDNAmaker；1-5.0×107、2-5.0×106、3-5.0×105、4-5.0×104、5-5.0×103、6-5.0×102、7-5.0×101、8-5.0×100、9-5.0×10-1CFU/mL；10-阴性对照）；图5为RT-LAMP的特异性实验中凝胶电泳及钙黄绿素染色结果图（A图:M-250bpDNAmaker；1肺结核患者痰标本、2-葡萄菌肺炎患者痰标本、3-铜绿假单胞菌肺炎患者痰标本、4-肺炎克雷伯肺炎患者痰标本；B图:M-250bpDNAmaker；1-结核杆菌H37Rv、2-胞内分枝杆菌、3-海分枝杆菌、4-堪萨斯分枝杆菌、5-鸟结核分枝杆菌、6-浅黄分枝杆菌、7-耻垢分枝杆菌、8-偶发分枝杆菌、9-龟分枝杆菌）；图6为RT-LAMP检测极限实验中RT-LAMP凝胶电泳及钙黄绿素染色结果图（图中：M-250bpDNAmaker；1-0.1ng、2-10p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RT‑LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物，其特征在于：所述RT‑LAMP的引物组合物包括：正向外引物F3：5’‑TCCTGGCTCAGGACGAAC‑3’；反向外引物B3：5’‑CGCTTTCCACCACAAGACAT‑3’；正向内引物FIP：5’‑TCGCCACTCGAGTATCTCCGAAGCGGCGTGCTTAACACAT‑3’；反向内引物BIP：5’‑AGTAACACGTGGGTGATCTGCCATCCCGTGGTCCTATCCG‑3’；反向环引物LB：5’‑ATAAGCCTGGGAAACTGGGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物，其特征在于：所述RT-LAMP的引物组合物包括：正向外引物F3：5’-TCCTGGCTCAGGACGAAC-3’；反向外引物B3：5’-CGCTTTCCACCACAAGACAT-3’；正向内引物FIP：5’-TCGCCACTCGAGTATCTCCGAAGCGGCGTGCTTAACACAT-3’；反向内引物BIP：5’-AGTAACACGTGGGTGATCTGCCATCCCGTGGTCCTATCCG-3’；反向环引物LB：5’-ATAAGCCTGGGAAACTGGGT-3’。2.一种用于检测结核分枝杆菌活菌的RT-LAMP试剂盒，包括RT-LAMP扩增反应液，其特征在于：所述RT-LAMP扩增反应液为25μL，包括如权利要求1所述的RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物；所述RT-LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物包括0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.8μM反向环引物LB；所述RT-LAMP扩增反应液还包括0.8M甜菜碱、8mMMgSO4、1.4mMdNTPs，8UBstDNA聚合酶、20U重组核糖核酸酶抑制剂、100UM-MLV反转录酶、2.5μL10×buffer，1μL模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙殿兴，吴丹丹，亢继文，李保胜，牛莉娅，
申请(专利权)人：中国人民解放军白求恩国际和平医院，
类型：发明
国别省市：河北,13