结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白、制备方法及其在结核病诊断中的应用技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白、制备方法及其在结核病诊断中的应用。本发明专利技术的结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；本发明专利技术提供了结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白的克隆，表达和纯化方法；本发明专利技术首次报道了Rv0189c蛋白用于结核病的血清学方法诊断，具有较高的敏感性和特异性，且具有更为快速和安全可靠的优点。

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白、制备方法及其在结核病诊断中的应用
本专利技术属诊结核病诊断
，具体涉及结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白、制备方法及其在结核病诊断中的应用。
技术介绍
结核病是当今全球面临的主要公共健康问题之一，它的病原体是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)，属分枝杆菌属。近年来，由于耐药结核病、人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核分枝杆菌感染、大规模人口流动等问题的出现，结核病疫情出现加重的趋势。目前，全球每年约有900万人发展成活动性结核，200万～300万人死于结核病。据估计，目前全世界约有1/3的人口感染了Mtb，其中绝大多数为潜伏性结核感染(latenttuberculosisinfection,LTBI)，即机体的免疫系统能够控制结核杆菌的复制而不发展成为结核病，但又不能将其彻底清除的状态。此时结核杆菌处于潜伏状态，在在免疫力低下者中，结核杆菌能够重新复制，发展成为活动性肺结核从而成为新的传染源。感染者终生约有5％～10％的风险发展成为活动性结核病，若同时伴有HIV的感染，这种概率则高达每年10％，远高于HIV阴性者。流行病学调查显示约有85％～90％新诊断的活动性肺结核系结核菌素试验阳性的LTBI演变而来。因此，对LTBI者的进行早期诊断和预防性治疗，既能够减少已感染结核杆菌者的发病机会，又可以通过影响发病，来减少结核杆菌在人群中的传播。为了控制结核病的疫情，急需有效地诊断方法来诊断活动性结核病和潜伏性结核感染。目前结核病确诊的主要依据依然是细菌学检查(包括培养和涂片)。但结核杆菌的培养需要很长的时间(6～8周)，不利于临床结核病的诊断和治疗；痰涂片法虽然简便、快速，但是敏感性很低，平均检出率只有25％～35％。此外，对于肺外结核(如骨关节结核、淋巴结核等)细菌学检查阳性率普遍偏低，有时还存在取样的困难。潜伏性结核感染的特点决定了其无法被细菌学方法检出。目前诊断LTBI应用最为广泛的方法仍是结核菌素试验(TST)，TST所使用的抗原PPD，是从结核分枝杆菌粗提的抗原混合物，其中有200多种抗原成分与卡介苗(BCG)和非结核分枝杆菌的抗原成分相同，容易发生交叉反应，使TST方法出现了较高的假阳性率，诊断的特异性较低。此外，TST对于近期免疫受抑制的病人特别是合并HIV感染、重症疾病者、年幼儿童及营养不良者，缺乏足够的灵敏度。自1976年Hassau等建立用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗结核分支杆菌抗体的方法以来，结核病的血清学诊断方法得到飞速发展，技术日益成熟，并得到了越来越广泛的应用。血清学诊断具有快速、简便、低廉且不需要活细胞等优点。这些年来，在血清学诊断抗原方面的研究已经取得了相当大的进步，确认了几个很有希望的血清学抗原，如38kDa,Lipoarabinomannan(LAM)，16kDa(Rv2031c),MTB81(Rv1837c),ESAT-6(Rv3875),Antigen85B(Rv1886c),Antigen60以及选取不同蛋白的融合蛋白等.目前已有数种商品化的结核血清学诊断试剂盒，包括应用结核抗原Antigen60的Anda-TB检测(AndaBiologicals，Strasbourg,France)，应用LAM及38kDa抗原的PathozymeMyco及应用38kDa和16kD抗原的PathozymeTBComplexPlus(OmegaDiganostics,Allo,Scotland,UK)及应用LAM抗原的MycoDot(Blackstone,Massachusetts,USA)。对现有商品化试剂盒的meta分析表明,无论是在肺结核还是肺结核的诊断中，现有的商品化血清学检测方法均未达到理想的诊断效果。因此，发现新的血清学诊断抗原标志物，并建立新的结核病免疫诊断方法是结核病诊断所急需的。
技术实现思路
为了克服目前结核杆菌免疫诊断方面存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白及其制备方法，将其应用于结核病的诊断，使得诊断具备较高的敏感性和特异性，并且更为快速和安全。本专利技术提供一种结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术所述的Rv0189c蛋白能够制备诊断试剂，用于结核病的免疫检测。本专利技术中所述的蛋白除了通常所指的一种氨基酸聚合物，还应该包括其类似物如多肽。多肽可与上述蛋白序列同源，这个类似物能够与蛋白同样结合到相同的抗体分子上，且类似物中处于等价位置上的氨基酸与原始肽中的那些抗原序列相同或保守。本专利技术所述的蛋白和多肽可以通过天然分离获得，也可以通过人工合成。一种具有代表性的方法是用较长的融合蛋白制备上述肽段，次融合蛋白包含上述代表性的肽段序列。所述肽也可由多肽经过物理或化学裂解所产生。本专利技术还提供一种结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：1).以结核分枝杆菌菌株基因组DNA为模板，扩增结核分枝杆菌Rv0189c基因；2)将结核分枝杆菌Rv0189c基因插入表达质粒；3)将构建的表达质粒转化入表达宿主(如E.coli)；4)诱导表达结核分枝杆菌Rv0189c蛋白；5)分离纯化诱导表达产物，得到结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白。本专利技术的Rv0189c基因序列可以应用PCR扩增法获得。可根据本专利技术所公开的相关核苷酸序列，尤其是开放读码框架来设计引物，在实施例1中，我们在制备结核分枝杆菌Rv0189c基因中采用的上下游引物为：Rv0189c-F(KpnI):cctggtaccgagaacctgtacttccaaggcatgccgcaaaccaccgacgaagccgc(SEQIDNO：2)Rv0189c-R(HindIII):ccgaagcttctagccgcagaccgcgccgaccgcggcag(SEQIDNO：3)本专利技术中，重组蛋白所用的表达质粒可以是pET32a等。本专利技术中，诱导表达Rv0189c可以采用多种方法，如使用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。本专利技术中，分离纯化重组Rv0189c蛋白也可以采用多种方法，如亲和层析、离子交换层析或分子筛等。上述制备方法中，各种实验参数均按常规操作选择，可视具体实验条件而定。本专利技术还提供一种上述结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白在制备诊断结核杆菌感染的试剂中的应用。应用上述结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白，Rv0189c特异性抗体及其基因引物可以用于制备结核杆菌感染诊断试剂。本专利技术进一步提供一种结核病检测试剂盒，其组分中的检测抗原是所述结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白。在本专利技术中，采用多孔塑料或聚酯板作为反应界面，由于抗原蛋白可以与之非特异性结合，样本中的抗原特异性抗体能够与包被Rv0189c抗原的多孔板相互作用，形成的抗原抗体复合物与酶联的第二抗体进行反应，洗去未结合的酶标抗体，加入底物后产生带有颜色的产物，在检测仪上测得增加的光吸收值。本专利技术中所涉及的可用于检测的免疫反应包括酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)，免疫沉淀实验，免疫凝集实验，免疫荧光实验，胶体金免疫层析法等本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1、制备结核分枝杆菌基因组DNA并应用PCR方法扩增Rv0189c基因；2、Rv0189c基因插入表达质粒；3、将构建好的表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：王森，张文宏，张颖，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31