活动性结核病诊断分子的筛选与应用制造技术

本发明专利技术提供了活动性结核病诊断分子的筛选与应用。具体地，本发明专利技术公开了结核分枝杆菌重要抗原的高通量筛选及其在活动性结核病诊断中的应用。本发明专利技术人基于GST融合表达的高通量功能蛋白筛选技术，筛选到92个能被结核病病人血清识别的阳性抗原，其中14个抗原呈现强阳性反应。活动性结核血清学检测表明，用这些阳性抗原检测活动性结核病具有较高的敏感性和特异性。将其中的TBGP1、TBGP2、TBGP3、TBGP4、TBGP5和TBGP6这6个蛋白组成的抗原组合，用作结核病血清学检测，经实验室验证表明，该组合检测结核分枝杆菌具有较高敏感性和特异性，在结核病诊断和监测中具有应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及活动性结核病诊断分子的筛选与应用。
技术介绍
结核病(Tuberculosis)是由结核分枝杆菌复合群(MycobacteriumTuberculosisComplex)感染引起的、以呼吸系统感染为主的传染性疾病。由于卡介苗(BCG)的专利技术和有效治疗结核病药物的广泛使用，结核病一度得到有效控制。自上个世纪90年代以来，由于全球化带来的人口大规模流动、抗生素的滥用，加之人们对结核病防范意识的松懈，结核病死灰复燃，卷土重来，成为严重威胁人类健康的重要传染性疾病。WHO等国际组织在本世纪初制定了以遏制结核病流行的千年发展目标计划，虽然一定程度上减少了结核病的新发病率和死亡率，但成效并不显著，结核病没有完全得到消除，全球结核病的防控形势依然严峻。据估计，全球有近1/3人口感染结核分枝杆菌，约有2000万结核病人，每年有860万新发病例，至少130万人死于该病。目前全球结核病负担最重的国家主要集中在亚洲和非洲，我国在22个结核病高负担国家中结核患者人数居世界第二。事实上，由于耐多药结核菌株、广泛耐药结核菌株等的出现，HIV/AIDS在结核病流行区域的传播，以及传统结核病疫苗卡介苗(BCG)的免疫保护作用降低，结核问题变得更加复杂。缺少有效的结核感染诊断方法是结核病难以根除的一个重要原因。传统的结核病诊断方法有很多不足，痰涂片镜检检出率低，痰结核菌培养费时费力，影像学检查作为辅助手段无法精确识别微小病灶等。近年来发展的结核诊断技术有PCR扩增技术、快速痰培养、以及新型影像学等，但是这些技术在发展中国家受到费用限制，并且不适合大规模监视和筛查。TST是应用最广的结核感染检测手段，但是其敏感性低，且易受卡介苗(BCG)接种影响，与其他分枝杆菌存在交叉感染等。IGRAs通过检测机体内结核分枝杆菌特异性抗原刺激后引起的γ干扰素释放诊断结核感染情况。与TST相比，IGRAs由于使用RD(regionofdifference)区缺失基因编码的抗原，如CFP-10，ESAT-6和TB7.7等，在卡介苗广泛接种地区具有较高的特异性，但是其敏感性仍有待提高，特别是在免疫抑制人群中会出现较多无法判定的结果。此外，TST和IGRAs两者均不能区分活动性结核和潜伏性结核，这使得其在结核病高流行地区的临床应用中受到极大地限制。因此，本领域迫切需要开发更准确有效的结核感染诊断方法和工具。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供准确有效的结核感染诊断方法和工具。在本专利技术的第一方面，提供了一种结核阳性抗原组合(或抗原集)，所述的抗原组合包括n种活动性结核抗原，其中，n为5-100的正整数，并且所述的活动性结核抗原选自下组：(a)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽；(b)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽与GST的融合蛋白；(c)由(a)中2-10个(较佳地3-7个)多肽融合形成的融合多肽；(d)上述(a)、(b)和(c)的任意组合。在另一优选例中，n为6-50，更佳地n为6-20。在另一优选例中，所述的抗原组合包括选自下组的活动性结核抗原：(a1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽；(b1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽与GST的融合蛋白；(c1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽与其他不同的活动性结核抗原融合形成的融合多肽。在另一优选例中，所述抗原组合包括氨基酸序列分别如SEQIDNO：1、2、3、4、5和6所示的6种多肽或其相应的融合蛋白或融合多肽。在另一优选例中，所述抗原组合包括氨基酸序列分别如SEQIDNO：1-14所示的14种多肽或其相应的融合蛋白或融合多肽。在另一优选例中，所述抗原组合包括氨基酸序列分别如SEQIDNO：5、6、8、9、10、11、12和14所示的1、2、3、4、5、6、7或8种多肽或其相应的融合蛋白或融合多肽。在另一优选例中，所述抗原组合包括氨基酸序列分别如SEQIDNO：1和2所示的2种多肽或其相应的融合蛋白或融合多肽。在另一优选例中，所述抗原组合的活动性结核的检测准确性≥60％(更佳地≥60％)且灵敏度≥85％(更佳地≥88％)。本专利技术还提供了一种活动性结核抗原，选自下组：(a)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽；(b)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽与GST的融合蛋白；(c)由(a)中2-10个(较佳地3-7个)多肽融合形成的融合多肽。在本专利技术的第二方面，提供了第一方面所述阳性抗原或结核阳性抗原组合的用途，用于制备检测活动性结核的试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述的试剂包括血清检测试剂、检测板、或芯片。在本专利技术的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下组：(a)编码第一方面所述阳性抗原或抗原组合的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸.在另一优选例中，所述的多核苷酸为编码SEQIDNO:1-14任一所示的(较佳地编码SEQIDNO:1-6所示)氨基酸序列的多核苷酸。在另一优选例中，所述的多核苷酸为编码SEQIDNO:5、6和8中任一所示的氨基酸序列的多核苷酸。在本专利技术的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有第三方面所述的多核苷酸。在本专利技术的第五方面，提供了一种宿主细胞，它含有第四方面所述的载体，或其染色体整合有第三方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌。在本专利技术的第六方面，提供了一种制备结核分枝杆菌阳性抗原的方法，包括步骤：(a)在适合表达的条件下，培养第五方面所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的结核分枝杆菌阳性抗原。在另一优选例中，所述抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:1-14任一所示；较佳地，所述抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:1-6所示。在另一优选例中，所述抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:5、6和8中任一所示。在本专利技术的第七方面，提供一种用于检测活动性结核的试剂盒，所述试剂盒包括：容器或载体；以及位于所述容器内或载体上的本专利技术第一方面所述的阳性抗原组合。在另一优选例中，所述的阳性抗原组合中各活动性结核抗原分别位于不同的容器内、或者分别位于不同的载体上，或者分别位于载体的不同检测区(或检测点)。在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书；较佳地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。在另一优选例中，所述的固相载体上包被有氨基酸序列如SEQIDNO：1-6所示的阳性抗原，以及任选的选自氨基酸序列如SEQIDNO：7-92所示的一种或多种阳性抗原(尤其是SEQIDNO.:8所示的阳性抗原)。在另一优选例中，所述的试剂盒或试剂用于检测待测样本是否感染结核分枝杆菌。在另一优选例中，所述待测样本来自结核分枝杆菌流行区人群。在本专利技术的第八方面，提供一种检测活动性结核的试剂，所述试剂包括：固相载体以及包被于所述固相载体上的本专利技术第一方面所述的阳性抗原组合。在另一优选例中，所述的试剂为蛋白芯片。在另一优选例中，所述的蛋白芯片用于检测血液样品或血清样品。在另一优选例中，所述阳性抗原组合中各活动性结核抗原分别位于不同的载体上，或者分别位于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核阳性抗原组合(或抗原集)，其特征在于，所述的抗原组合包括n种活动性结核抗原，其中，n为5‑100的正整数，并且所述的活动性结核抗原选自下组：(a)序列如SEQ ID NO.:1‑92中任一所示的多肽；(b)序列如SEQ ID NO.:1‑92中任一所示的多肽与GST的融合蛋白；(c)由(a)中2‑10个(较佳地3‑7个)多肽融合形成的融合多肽；(d)上述(a)、(b)和(c)的任意组合。

【技术特征摘要】
1.一种结核阳性抗原组合(或抗原集)，其特征在于，所述的抗原组合包括n种活动性结核抗原，其中，n为5-100的正整数，并且所述的活动性结核抗原选自下组：(a)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽；(b)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽与GST的融合蛋白；(c)由(a)中2-10个(较佳地3-7个)多肽融合形成的融合多肽；(d)上述(a)、(b)和(c)的任意组合。2.如权利要求1所述的抗原组合，其特征在于，所述的抗原组合包括选自下组的活动性结核抗原：(a1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽；(b1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽与GST的融合蛋白；(c1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽与其他不同的活动性结核抗原融合形成的融合多肽。3.如权利要求1所述的抗原组合，其特征在于，所述抗原组合包括氨基酸序列分别如SEQIDNO：1、2、3、4、5和6所示的6种多肽或其相应的融合蛋白或融合多肽。4.如权利要求1所述的抗原组合，其特征在于，所述抗原组合包括氨基酸序列分别如SEQIDNO：1-14所示的14种多肽或其相应的融合蛋白或融合多肽。5.一种如权利要求1所述的结核阳性抗原组合的用途，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘卫庆，徐新东，周方斌，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31