一种缩宫素的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种缩宫素的制备方法，以CTC树脂为固相载体，采用固相合成法合成第一中间体，液相合成法合成第二中间体，然后再将两个中间体缩合得到缩宫素前体，将所述缩宫素前体依次脱去其中的Trt和切肽，得到缩宫素。本发明专利技术提供的制备方法简化了缩宫素的制备步骤，降低了缩宫素制备成本，具有较高的产率；而且本发明专利技术制备得到的缩宫素具有较高的纯度和效价。实施例结果表明，本发明专利技术提供的方法制备得到的缩宫素纯度高达99％以上，缩宫素纯化产率高达46.5％，生物效价高达560IU/mg以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽合成
，尤其涉及一种缩宫素的制备方法。
技术介绍
缩宫素又称催产素，是一种子宫收缩药，临床用于催产、引产、防治产后出血和产后复旧不全，并有促进泌乳作用。目前，国内的缩宫素原料药基本上自猪或牛下丘脑垂体后叶中提取，效价160IU/ml，效价低，并且动物来源的产品存在生物安全性风险，同时存在加压素等杂质，难以被纯化除去。人工合成缩宫素的方法主要包括固相合成法和液相合成法，目前，缩宫素合成方法主要有液相法和Fmoc固相法。其中，中国专利技术专利ZL2010102549195公布了一种液相合成缩宫素的方法:该方法用金属钠/液氨法脱去保护基，然后，用空气氧化法形成二硫键，收率25％，未见生物效价报道；中国专利技术专利(专利号ZL2005101123565)公布了一种固相合成缩宫素的方法:该方法以RinkAmide树脂为固相载体，Fmoc保护氨基酸为单体，其中半胱氨酸采用Fmoc-Cys(Trt)-OH，使用哌啶作为脱帽试剂，依次逐个合成了保护缩宫素氨基酸序列，然后，将肽链从树脂上切割下来，乙醚沉淀切肽溶液获得还原性缩宫素后，在偏碱性溶液中(pH7-8)用空气、或双氧水进行氧化，形成二硫键，收率21％，未见报道效价；中国专利技术专利(ZL201210256922X)公布了一种固相合成缩宫素的方法:该方法以RinkAmide树脂为固相载体，Fmoc保护氨基酸为单体，其中N末端半胱氨酸采用Boc-Cys(Trt)-OH，使用哌啶作为脱帽试剂，依次逐个合成了保护缩宫素氨基酸序列，然后，将肽链从树脂上切割下来，乙醚沉淀切肽溶液获得未环化的缩宫素后，在偏碱性溶液中用空气、或双氧水进行氧化，形成二硫键，其收率33％，未见报道效价。这些缩宫素固相合成法的共同点是：1)环化反应均采用空气氧化法、或双氧水氧化法形成二硫键，收率最高为33％；2)N末端氨基在未保护(游离)状态下进行环化反应；3)脱帽试剂均采用易制毒化学品哌啶；4)未见报道缩宫素的生物效价、或可参考的生物效价。综上所述，使用易制毒化学品哌啶、乙醚等，难以掌控的反应条件(如金属钠/液氨等)；现有技术中缩宫素的合成方法反应步骤多，产率、纯度不能满足需求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种工艺简单、成本低，产率高的缩宫素合成方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种缩宫素的制备方法，包括以下步骤：1)以CTC树脂为固相载体，将氨基酸保护单体Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，，和Boc-Cys(Trt)-OH在缩合剂和碱性条件下依次进行缩合反应，得到第一中间体；脱帽试剂为哌嗪溶液，所述第一中间体的氨基酸序列为：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-OH；2)以Fmoc-Pro-Leu-OH，Gly-NH2，BOP，HOBt为原料，合成Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2，用二乙胺脱去Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2上的Fmoc得到第二中间体；所述第二中间体的氨基酸序列为：H-Pro-Leu-Gly-NH2；3)将步骤1)中合成的第一中间体和步骤2)中合成的第二中间体进行缩合反应，得到缩宫素前体1，所述缩宫素前体的氨基酸序列为：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2；4)用碘脱去所述步骤3)中得到的缩宫素前体1中Cys上的Trt，形成二硫键，得到缩宫素前体2；所述缩宫素前体2的氨基酸序列为：5)将步骤4)中得到的缩宫素前体2切肽后得到具有式I所示结构的缩宫素；所述步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。优选的，步骤1)中所述的哌嗪溶液的溶剂为DMF，所述的哌嗪溶液浓度为0.1～1M。优选的，所述步骤1)中CTC树脂的取代度为0.6～0.9mmol/g。优选的，所述步骤1)中每种氨基酸保护单体在反应体系中的浓度为树脂取代度的1.95～2.05当量。优选的，所述步骤1)中缩合剂为O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；所述的缩合剂在反应体系中的浓度为缩合反应中对应氨基酸保护单体的0.95-1当量。优选的，所述步骤1)中提供碱性条件的碱为N,N-二异丙基乙胺，所述N,N-二异丙基乙胺为缩合反应对应氨基酸保护单体的1～1.5当量。优选的，所述步骤3)中第二中间体为第一中间体的1.02～1.5当量。优选的，所述步骤3)中缩合反应用缩合剂为叠氮磷酸二苯酯或二环己基碳二亚胺-1-羟基苯并三唑或二环己基碳二亚胺-3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮。所述的缩合剂在反应体系中的浓度为缩合反应中第二中间体的0.95-1当量优选的，所述步骤4)中的碘为单质碘；所述碘的物质的量为缩宫素前体物质的量的5～10当量，所述碘在反应体系中的浓度为0.1M～0.5M。优选的，所述步骤5)中切肽用试剂为含TIS的三氟乙酸溶液。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种缩宫素的制备方法，未使用任何剧毒或易制毒化学品，也未使用任何有安全隐患的工艺。本专利技术以CTC树脂为固相载体，采用多肽固相合成法合成第一中间体，多肽液相合成法合成第二中间体，然后再将两个中间体缩合得到缩宫素前体，将所述缩宫素前体依次环化和切肽，得到缩宫素粗品。本专利技术提供的制备方法简化了缩宫素的制备步骤，所述的固相合成载体CTC树脂可以回收使用，极大降低了缩宫素的生产成本，本专利技术结合了固相合成和液相合成的优点，具有较高的合成效率和产率；而且本专利技术制备得到的缩宫素具有较高的纯度。另外本申请所述的制备方法中用哌嗪溶液代替哌啶溶液作为脱帽试剂，易于购买、运输和储存，且哌嗪不属于受控制的易制毒化学品，方便企业的物料管理。实施例结果表明，本专利技术提供的方法制备得到的缩宫素纯度高达99％以上，产率高达46.5％，生物效价高达560IU/mg以上。附图说明：图1是实施例1中第一中间体的RP-HPLC图；图2是第一中间体高酸裂解样品的ESI-MS图；图3是Fmoc-Pro-OSu的RP-HPLC图；图4是Fmoc-Pro-Leu-OH的RP-HPLC图；图5是Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2的RP-HPLC图；图6是第二中间体的RP-HPLC图；图7是第二中间体的ESI-MS图；图8是缩宫素前体1的RP-HPLC图；图9是缩宫素前体1高酸裂解样品的ESI-MS图；图10是缩宫素前体2的RP-HPLC图；图11是缩宫素粗品的RP-HPLC图；图12是缩宫素纯品的RP-HPLC图；图13是缩宫素的ESI-MS图；图14是实施例2中的第一中间体的HPLC图。具体实施方式在本专利技术权利要求书和说明书中出现物质的英文缩写对应的中文名称见表1。表1本专利技术中出现物质的英文缩写对应的中文名称英文缩写中文名称Fmoc9-芴甲氧羰基Trt三苯甲基HOBt1-羟基苯并三唑Boc叔丁氧羰基tBu叔丁基TFA三氟乙酸TIS三异丙基硅烷DIEAN,N-二异丙基乙胺HBTUO-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缩宫素的制备方法，包括以下步骤：1)以CTC树脂为固相载体，将氨基酸保护单体Boc‑Cys(Trt)‑OH、Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Gln(Trt)‑OH、Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、Fmoc‑Cys(Trt)‑OH在缩合剂和碱性条件下依次进行缩合反应，得到第一中间体；所述缩合反应用脱帽试剂为哌嗪，所述第一中间体的氨基酸序列为：Boc‑Cys(Trt)‑Tyr(tBu)‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑OH；2)以Fmoc‑Pro‑Leu‑OH、Gly‑NH2、BOP和HOBt为原料，合成Fmoc‑Pro‑Leu‑Gly‑NH2，用二乙胺脱去所述Fmoc‑Pro‑Leu‑Gly‑NH2中的Fmoc，得到第二中间体；所述第二中间体的氨基酸序列为：H‑Pro‑Leu‑Gly‑NH2；3)将所述步骤1)得到的第一中间体和步骤2)得到的第二中间体进行缩合反应，所用的缩合剂为DCC‑HOOBt或DPPA或DCC‑HOBt，得到缩宫素前体1，所述缩宫素前体的氨基酸序列为：Boc‑Cys(Trt)‑Tyr(tBu)‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑NH2；4)用碘脱去所述步骤3)得到的缩宫素前体中的Trt，形成二硫键，再经切肽后得到具有式I所示结构的缩宫素；所述步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。...

【技术特征摘要】
1.一种缩宫素的制备方法，包括以下步骤：1)以CTC树脂为固相载体，将氨基酸保护单体Boc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH在缩合剂和碱性条件下依次进行缩合反应，得到第一中间体；所述缩合反应用脱帽试剂为哌嗪，所述第一中间体的氨基酸序列为：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-OH；2)以Fmoc-Pro-Leu-OH、Gly-NH2、BOP和HOBt为原料，合成Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2，用二乙胺脱去所述Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2中的Fmoc，得到第二中间体；所述第二中间体的氨基酸序列为：H-Pro-Leu-Gly-NH2；3)将所述步骤1)得到的第一中间体和步骤2)得到的第二中间体进行缩合反应，所用的缩合剂为DCC-HOOBt或DPPA或DCC-HOBt，得到缩宫素前体1，所述缩宫素前体的氨基酸序列为：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2；4)用碘脱去所述步骤3)得到的缩宫素前体中的Trt，形成二硫键，再经切肽后得到具有式I所示结构的缩宫素；所述步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的哌嗪以哌...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙鹏程，刘旭安，梁振纲，马小强，冯芳芳，
申请(专利权)人：兰州凯博药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62