一种区分活动性及潜伏性结核感染的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种区分活动性及潜伏性结核感染的试剂盒，以结核分枝杆菌Rv0189c蛋白或其类似物作为诊断标志物。本发明专利技术通过ELISA方法对受试者的血液或体液标本进行检测，用于区分活动性和潜伏性结核感染，单独使用其敏感性达到62.4％，特异性为88.4％。当与其他诊断抗原(如16kD,LAM)合用，可进一步提高诊断的敏感性。本发明专利技术的检测只需要单份样品，化验简单、快速、不需要专业实验室设备，成本低廉，当天可得到结果，非常适合基层地区大规模的结核感染检测。

【技术实现步骤摘要】
一种区分活动性及潜伏性结核感染的试剂盒
本专利技术属结核病诊断
，具体涉及一种区分活动性及潜伏性结核感染的试剂盒。
技术介绍
结核病是当今全球面临的主要公共健康问题之一，它的病原体是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)，属分枝杆菌属。近年来，由于耐药结核病、人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核分枝杆菌感染、大规模人口流动等问题的出现，结核病疫情出现加重的趋势。目前，全球每年约有900万人发展成活动性结核，200万～300万人死于结核病。据估计，目前全世界约有1/3的人口感染了Mtb，其中绝大多数为潜伏性结核感染(latenttuberculosisinfection,LTBI)，即机体的免疫系统能够控制结核杆菌的复制而不发展成为结核病，但又不能将其彻底清除的状态。此时结核杆菌处于潜伏状态，在在免疫力低下者中，结核杆菌能够重新复制，发展成为活动性肺结核从而成为新的传染源。感染者终生约有5％～10％的风险发展成为活动性结核病，若同时伴有HIV的感染，这种概率则高达每年10％，远高于HIV阴性者。流行病学调查显示约有85％～90％新诊断的活动性肺结核系结核菌素试验阳性的LTBI演变而来。因此，对LTBI者的进行早期诊断和预防性治疗，既能够减少已感染结核杆菌者的发病机会，又可以通过影响发病，来减少结核杆菌在人群中的传播。自1976年Hassau等建立用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗结核分支杆菌抗体的方法以来，结核病的血清学诊断方法得到飞速发展，技术日益成熟，并得到了越来越广泛的应用。血清学诊断具有快速、简便、低廉且不需要活细胞等优点。这些年来，在血清学诊断抗原方面的研究已经取得了相当大的进步，确认了几个很有希望的血清学抗原，如38kDa,Lipoarabinomannan(LAM)，16kDa(Rv2031c),MTB81(Rv1837c),ESAT-6(Rv3875),Antigen85B(Rv1886c),Antigen60以及选取不同蛋白的融合蛋白等.目前已有数种商品化的结核血清学诊断试剂盒，包括应用结核抗原Antigen60的Anda-TB检测(AndaBiologicals，Strasbourg,France)，应用LAM及38kDa抗原的PathozymeMyco及应用38kDa和16kD抗原的PathozymeTBComplexPlus(OmegaDiganostics,Allo,Scotland,UK)及应用LAM抗原的MycoDot(Blackstone,Massachusetts,USA)。对现有商品化试剂盒的meta分析表明,无论是在肺结核还是肺结核的诊断中，现有的商品化血清学检测方法均未达到理想的诊断效果。因此，发现新的血清学诊断抗原标志物，并建立新的结核病免疫诊断方法以及相应的试剂盒是结核病诊断所急需的。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的一种特异性和敏感性俱佳的结核快速检测试剂及相应的试剂盒。本专利技术的检测试剂盒检测只需要单份血清样品，化验简单、快速、不需要专业实验室设备，成本低廉。为了实现上述技术目的，本专利技术提供的技术措施包括：本专利技术首先公开了一种用于区分活动性及潜伏性结核感染的检测抗原Rv0189c抗原。该抗原是由结核分枝杆菌基因Rv1985c所编码的蛋白。结核杆菌Rv1985c蛋白包含575个氨基酸，分子量59.4kDa。该蛋白具有SEQIDNO：1的氨基酸序列。本专利技术所述的Rv0189c抗原能够制备结核性血清学诊断试剂，用于区分活动性及潜伏性结核感染。本专利技术的再一个目的是提供一种快速检测结核病的诊断试剂盒。它包含上述重组蛋白Rv0189c和Rv0189c抗体的阳性对照试剂，这类试剂可以是含Rv1985c阳性抗体的动物血清或通过杂交瘤细胞培育出的Rv1985c单克隆抗体。如待测者体液中抗体的滴度超过了阳性对照试剂，则判定为阳性。本专利技术涉及的试剂盒中，除了有重组抗原Rv0189c和其特异性抗体外，还应用用于检测的各种试剂和器具，包括各种缓冲液、稀释液、反应液和终止液。本专利技术中所述的蛋白除了通常所指的一种氨基酸聚合物，还应该包括其类似物如多肽。多肽可与上述蛋白序列同源，这个类似物能够与蛋白同样结合到相同的抗体分子上，且类似物中处于等价位置上的氨基酸与原始肽中的那些抗原序列相同或保守。本专利技术所述的蛋白和多肽可以通过天然分离获得，也可以通过人工合成。一种具有代表性的方法是用较长的融合蛋白制备上述肽段，次融合蛋白包含上述代表性的肽段序列。所述肽也可由多肽经过物理或化学裂解所产生。本专利技术中所涉及的可用于检测的免疫反应包括酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)，免疫沉淀实验，免疫凝集实验，免疫荧光实验，胶体金免疫层析法等。在本专利技术中，采用多孔塑料或聚酯板作为反应界面，由于抗原蛋白可以与之非特异性结合，样本中的抗原特异性抗体能够与包被Rv0189c抗原的多孔板相互作用，形成的抗原抗体复合物与酶联的第二抗体进行反应，洗去未结合的酶标抗体，加入底物后产生带有颜色的产物，在检测仪上测得增加的光吸收值。本专利技术的另一重要目的是提供一种快速检测并区分活动性及潜伏性结核感染的方法，即本专利技术的试剂盒的使用方法，主要包括以下步骤:a)使用Rv0189c抗原包被96孔板或其他吸附蛋白介质；b)采集待测样品，通常是受试者的血清，稀释一定倍数；c)将稀释后样品加入介质中与Rv0189c反应；d)加入酶联或胶体金等染料偶联试剂，该试剂能与Rv0189c抗原抗体复合物特异反应。典型的试剂如:酶联Rv0189c多肤，ProteinA，抗IgG,IgM二抗等；e)直接显色或加入显色剂显色；f)肉眼或仪器读取颜色的改变，以超过一定域值的颜色改变判定为阳性检测。值得注意的是，该方法至少使用Rv0189c一种抗原用于检测相应抗体，但不局限于该种抗原。与其他有较高诊断价值的结核抗原，如LAM,38kDa,30kDa,16KDa,A60等抗原一起使用，可以提高检测的阳性检出率。本专利技术提供了一种特异性和敏感性俱佳的结核快速检测试剂，可应用受试者的血液或体液标本进行检测，并区分活动性结核病和潜伏性结核感染，具有较高临床应用价值。本专利技术的检测只需要单份血清样品，化验简单、快速、不需要专业实验室设备，成本低廉，当天可得到结果，非常适合基层地区大规模的结核感染检测。附图说明图1为活动性结核患者(ATB)和潜伏性结核感染者(LTBI)血清样本中Rv0189c特异性IgG抗体的检测含量。图2为血清样本中Rv0189c特异性IgG抗体诊断活动性结核患者(ATB)和潜伏性结核感染者(LTBI)的受试者工作曲线(ROC曲线)。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。实施例1.重组Rv0189c抗原作为检测试剂用于区分活动性及潜伏性结核感染1.收集临床标本(1)病史资料采集：采用问卷调查表形式，由专科医务人员分别调查入选病例的性别、年龄、BCG接种史、既往结核病病史、近期活动性结核密切接触史、慢性风湿性疾病诊断、入组前3个月免疫抑制剂治疗情况等相关病史。对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种区分活动性及潜伏性结核感染的试剂盒，其特征在于，包含有结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白或其类似物，所述结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种区分活动性及潜伏性结核感染的试剂盒，其特征在于，包含有结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白或其类似物，所述结核分枝杆菌Rv0189c重组蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含所述结核分...

【专利技术属性】
技术研发人员：王森，吴晶，陈嘉臻，邵凌云，张文宏，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31