检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法。所述ELISA试剂盒包括：ELISA反应板，重组FAdV‑4 fiber‑2蛋白，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，包被液，封闭液，洗涤液，底物显色液，和终止液。本发明专利技术试剂盒和检测方法适用于血清4型禽腺病毒的快速检测，具有操作简单、高特异性、高灵敏度、低成本的特点。

Indirect ELISA kit for detecting serum type 4 avian adenovirus antibody and detection method thereof

The invention discloses an indirect ELISA kit for detecting the antibody of serum type 4 avian adenovirus and a detection method thereof. The ELISA kit includes ELISA reaction plate, recombinant FAdV 4 fiber 2 protein, horseradish peroxidase labeled Rabbit anti chicken IgG antibody, coating liquid, sealing liquid, washing liquid, chromogenic substrate solution, and stop solution. The kit and the detection method of the invention are suitable for the rapid detection of the serum type 4 avian adenovirus, and has the characteristics of simple operation, high specificity, high sensitivity and low cost.

【技术实现步骤摘要】
检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及生物技术检测领域，特别是涉及一种用于检测血清4型禽腺病毒(FAdV-4)抗体的间接ELISA试剂盒及其制备方法。
技术介绍
禽腺病毒(Fowladenovirus，FAdV)属于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)。该病毒粒子无囊膜，直径约70-90nm，呈二十面体对称，由衣壳、纤突、核酸芯髓及相关蛋白构成。根据群特异性抗原的不同，禽腺病毒可分为3群(I-III群)。其中I群禽腺病毒包括从鸡、火鸡、鹅及其它禽类分离获得的腺病毒，其包含5个基因型(A-E)、12个血清型(1-11，8a，8b)。在FAdV的编码蛋白中，F2纤突蛋白(fiber-2)的氨基酸组成不保守，表面带有亚群及型的特异性抗原表位；同时，fiber-2蛋白可识别宿主细胞上的特异性受体，使病毒能够吸附于宿主细胞，这一功能与病毒的感染能力、组织嗜性及毒力密切相关。FAdV可经粪便、气管和鼻腔粘膜水平传播，也可垂直传播，主要为种鸡产蛋期感染后1～2周内经蛋传播给子代。鸡群感染后表现为包含体肝炎和心包积液的临床症状，引起死亡率在10％-80％之间，其中肝炎-心包积液综合征(Hepatitis-hydropericardiumsyndrome)也称“安卡拉”病是由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)引起，也是致病性最强的一个血清型。近年来国内报道FAdV-4感染有增多的趋势，给国内养禽业造成巨大经济损失。FAdV-4的诊断方法主要包括病毒的分离与鉴定，琼脂扩散试验，酶联免疫吸附试验等，病毒的分离与鉴定结果准确可信，但是检测周期长，操作繁琐，不利于疾病的快速诊断。目前国内市场上仅有的针对I群FAdV的通用抗体检测的商品化ELISA试剂盒，由于是国外进口产品，价格昂贵，并且不能用于血清4型FAdV抗体的特异性检测和FAdV-4疫苗免疫效果的评价。因此急需研发出针对血清4型FAdV的ELISA抗体检测试剂盒。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其具有操作简单、高特异性、高灵敏度、低成本的特点。本专利技术的另一目的在于提供一种通过所述间接ELISA试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，从而可以更简便、快捷、准确地检测血清4型禽腺病毒抗体。为实现上述目的，本专利技术提供了一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括：ELISA反应板，重组FAdV-4fiber-2蛋白，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，包被液，封闭液，洗涤液，底物显色液，和终止液。上述检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒在另一种实施方式中，所述重组FAdV-4fiber-2蛋白是通过如下步骤获得的：原核表达：以NCBI数据库中血清4型FAdVJSJ13株(GenBank登录号为KM096544)基因组序列作为参考，设计特异性引物，扩增FAdV-4JSJ13株fiber-2基因完整的开放阅读框，将其克隆至pET-32a原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中通过加入0.4-0.8mMIPTG诱导重组蛋白进行表达；蛋白纯化和复性：将重组菌株超声处理后，提取菌体沉淀进行亲和层析纯化，进而通过梯度透析法复性，获得可溶性FAdV-4fiber-2蛋白；蛋白鉴定：利用Westernblotting方法对纯化后的FAdV-4fiber-2蛋白进行鉴定。上述检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒在另一种实施方式中，所述FAdV-4fiber-2蛋白的基因序列扩增引物如下：上游引物：5’-CCGGATATCATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG-3’，插入EcoRV酶切位点；下游引物：5’-CCGAAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3’，插入HindIII酶切位点。上述检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒在另一种实施方式中，所述包被液为碳酸盐缓冲液，其通过称取NACO31.5g及NaHCO32.9g，加入900mL超纯水溶解后，定容至1000mL获得；可选的，所述洗涤液为PBST，并且所述PBST为含有体积分数0.05％吐温-20的PBS溶液；可选的，所述封闭液为5％脱脂乳，其通过将5g脱脂乳溶解于100mLPBS中获得；可选的，所述底物显色液为双组份TMB显色液；可选的，所述终止液为2mol/L稀硫酸。本专利技术还提供了一种通过所述间接ELISA试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，包括如下步骤：(1)包被：使用包被液将重组FAdV-4fiber-2蛋白稀释，将已稀释的蛋白加至ELISA反应板中，4℃包被过夜；(2)洗涤；(3)封闭：将封闭液加至ELISA反应板中，于37℃封闭；(4)洗涤；(5)孵育待检血清：以封闭液稀释待检血清样品，将已稀释的待检血清样品加至ELISA反应板中，于37℃孵育；(6)洗涤；(7)孵育酶标二抗：以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，将已稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体加至ELISA反应板中，于37℃孵育；(8)洗涤；(9)显色：每孔加入显色液，于37℃显色；(10)终止：每孔加入终止液，终止显色反应；(11)读数：将ELISA反应板置于酶标仪中，在450nm波长下测定OD450；(12)检测：利用统计学方法计算出阴性标准样品的平均值和标准差(SD)，样品则判定该样品为FAdV-4阳性。上述检测血清4型禽腺病毒抗体的方法在另一种实施方式中，包括如下步骤：(1)包被：使用包被液将重组FAdV-4fiber-2蛋白稀释至1-2μg/mL，将已稀释的蛋白以100μL/孔的量加至ELISA反应板中，4℃包被过夜；(2)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；(3)封闭：将封闭液以300μL/孔的量加至ELISA反应板中，于37℃封闭2h；(4)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；(5)孵育待检血清：以封闭液稀释待检血清样品50-300倍，将已稀释的待检血清样品以100μL/孔的量加至ELISA反应板中，于37℃孵育15-45min；(6)每孔加入300μL洗涤液洗涤3次；(7)孵育酶标二抗：以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体4000-8000倍，将已稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体以100μL/孔加至ELISA反应板中，于37℃孵育15-45min；(8)每孔加入300μL洗涤液洗涤ELISA反应板3次；(9)显色：将每孔加入100μL已混均的显色液，37℃显色5-15min；(10)终止：每孔加入50μL的终止液，终止显色反应；(11)读数：将ELISA反应板置于酶标仪中，在450nm波长下测定OD450；(12)检测：利用统计学方法计算出阴性标准样品的平均值和标准差(SD)，样品则判定该样品为FAdV-4阳性。上述检测血清4型禽腺病毒抗体的方法在另一种实施方式中，所述重组FAdV-4fiber-2蛋白被稀释至1.5μg/mL，所述待检血清样品被稀释200倍，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括：ELISA反应板，重组FAdV‑4fiber‑2蛋白，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，包被液，封闭液，洗涤液，底物显色液，和终止液。

【技术特征摘要】
1.一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括：ELISA反应板，重组FAdV-4fiber-2蛋白，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，包被液，封闭液，洗涤液，底物显色液，和终止液。2.根据权利要求1所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述重组FAdV-4fiber-2蛋白是通过如下步骤获得的：(1)原核表达：以NCBI数据库中血清4型FAdVJSJ13(KM096544)基因组序列作为参考，设计特异性引物，扩增FAdV-4fiber-2基因完整的开放阅读框，将其克隆至pET-32a原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达；(2)蛋白纯化和复性：将重组菌株超声处理后，提取菌体沉淀进行亲和层析纯化，然后通过梯度透析法复性，获得FAdV-4fiber-2蛋白。3.根据权利要求2所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述FAdV-4fiber-2蛋白的基因序列扩增引物如下：上游引物：5’-CCGGATATCATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG-3’；下游引物：5’-CCGAAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3’。4.根据权利要求1所述的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被液为碳酸盐缓冲液，其通过称取NACO31.5g及NaHCO32.9g，加入900mL超纯水溶解后，定容至1000mL获得；可选的，所述洗涤液为PBST，并且所述PBST为含有体积分数0.05％吐温-20的PBS溶液；可选的，所述封闭液为5％脱脂乳，其通过将5g脱脂乳溶解于100mLPBS中获得；可选的，所述底物显色液为双组份TMB显色液；可选的，所述终止液为2mol/L稀硫酸。5.一种使用权利要求1所述间接ELISA试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)包被：使用包被液将重组FAdV-4fiber-2蛋白稀释，将已稀释的蛋白加至ELISA反应板中，4℃包被过夜；(2)洗涤；(3)封闭：将封闭液加至ELISA反应板中，于37℃封闭；(4)洗涤；(5)孵育待检血清：以封闭液稀释待检血清样品，将已稀释的待检血清样品加至ELISA反应板中，于37℃孵育；(6)洗涤；(7)孵育酶标二抗：以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，将已稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体加至ELISA反应板中，于37℃孵育；(8)洗涤；(9)显色：每孔加入显色液，于37℃显色；(10)终止：每孔加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国中，赵静，何梓榕，阮思凡，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11