一种重组禽腺联病毒的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种重组禽腺联病毒的制备方法，包括：步骤一、利用重组DNA技术，制备三个重组杆状病毒转移载体；步骤二、将所述三个重组杆状病毒转移载体分别转座于DH10Bac感受态细胞，经过筛选后使用碱裂解法提取三个重组穿梭载体质粒DNA；以及步骤三、将所述三个重组穿梭载体质粒DNA同时与转染试剂PEI按照一定比例混匀后共同转染Sf9昆虫细胞，转染三天后制备产生了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒。本发明专利技术还提供了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒的应用。本发明专利技术制备的重组禽腺联病毒的病毒滴度为常规方法的十倍，同时该重组禽腺联病毒表达的人溶菌酶，能对常见病原菌产生抑菌作用。

Preparation method and application of recombinant fowl adenovirus

The invention discloses a preparation method of recombinant avian adeno-associated virus comprises the steps of: using recombinant DNA technology, preparation of three recombinant baculovirus transfer vector; step two, the three recombinant baculovirus transfer vector respectively to transposon DH10Bac competent cells, after screening using alkaline lysis method after the extraction of three recombinant shuttle plasmid DNA; and step three, the three recombinant shuttle plasmid DNA and PEI transfection reagent according to a certain proportion of mixing together after the transfection of Sf9 insect cells three days after transfection, preparation produced expression of human lysozyme recombinant avian adeno-associated virus. The invention also provides the application of recombinant avian adenovirus expressing human lysozyme. The virus titer of the recombinant avian adeno-associated virus prepared by the invention is ten times of that of the conventional method, and the human lysozyme expressed by the recombinant adenovirus can produce antibacterial action on common pathogenic bacteria.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒
，更具体地说，本专利技术涉及一种重组禽腺联病毒的制备方法及其应用。
技术介绍
溶菌酶是一种天然抗菌剂，溶菌酶不仅对许多革兰阳性细菌具有直接的溶菌作用，对革兰阴性菌以及一些真菌也有一定的抑制作用，对球虫菌发生一定抵抗能力，对病毒复制也有一定的抑制作用。同时，人溶菌酶对人和动物无毒性，不会出现药物残留带来的公共卫生问题，对人体无不良反应和副作用，即使长期使用，也不会产生耐药性。杆状病毒表达体系是20世纪80年代发展起来的真核表达系统，是基因工程中四大表达系统之一，其具有外源基因表达量较高、表达蛋白质生物学活性高和安全性高等优点，被广泛应用于基因工程、药物研发、疫苗生产等方面。重组禽腺联病毒的制备方法由多种，但是通过这些方法制备的重组禽腺联病毒的病毒滴度较低，大大降低了重组禽腺联病毒的使用范围。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供了一种重组禽腺联病毒的制备方法，该方法制备的重组禽腺联病毒不仅成功表达了具有活性作用的外源基因人溶菌酶，而且病毒滴度为常规方法的近10倍。本专利技术还有一个目的是制备的表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒对常见病原菌能够产生抑制作用。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种重组禽腺联病毒的制备方法，包括：步骤一、利用重组DNA技术，制备三个重组杆状病毒转移载体，分别标记为pFastBac-AITR-LYZ、pFastBac1-VP、pFastBac-Dual-Rep；步骤二、将所述三个重组杆状病毒转移载体分别转座于DH10Bac感受态细胞，经过筛选后使用碱裂解法提取三个重组穿梭载体质粒DNA，分别标记为Bacmid-AITR-LYZ、Bacmid-VP、Bacmid-Rep；以及步骤三、将所述三个重组穿梭载体质粒DNA同时与转染试剂PEI按照一定比例混匀后共同转染Sf9昆虫细胞，转染三天后制备产生了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒。优选的是，所述的重组禽腺联病毒的制备方法中，所述步骤一中，所述三个重组杆状病毒转移载体的制备方法为：以pAITR-KLKI、p215C3LYZ为模板，将鸡卵清蛋白基因启动子控制的人溶菌酶基因表达盒插入AAAV的左右ITR之间，获得了标记为pFastBac-AITR-LYZ的重组杆状病毒转移载体；以pCR-AAAV为模板，利用PCR方法扩增翻译起始序列修饰的AAAVVP基因，插入杆状病毒表达pFastBac1载体，获得了标记为pFastBac1-VP的重组杆状病毒转移载体；将pQE-Trisystem中的Δp10启动子-polyA片段插入pFastBac1载体，构建了杆状病毒-昆虫细胞双表达载体pFastBac-DualI，以pCR-AAAV为模板，利用PCR方法分别扩增AAAV的Rep78和Rep52基因，再将扩增后的Rep78和Rep52基因通过DNA重组插入所述杆状病毒-昆虫细胞双表达载体pFastBac-DualI，获得了标记为pFastBac-Dual-Rep的重组杆状病毒转移载体。其中，pAITR-KLK1是将禽腺联病毒的ITR与KLK1通过重组DNA技术克隆入商品化载体pUCm-T而获得；p215C3LYZ是将LYZ与改造后pcDNA3通过重组DNA技术构建的。优选的是，所述的重组禽腺联病毒的制备方法中，所述表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒的病毒滴度为2.9×1011v.g./mL。本专利技术还提供了一种上述重组禽腺联病毒的应用，所述表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒可抑制常见病原菌的活性，具体为：对表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒进行纯化和浓缩，量取纯化好的表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒25μL，在固体培养基平板上分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和白色念珠菌进行体外抑菌活性试验。所述表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒均可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和白色念珠菌，其抑制圈分别为20mm、20mm、17mm、16mm和14mm。本专利技术至少包括以下有益效果：1、本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法制备的重组禽腺联病毒不仅成功表达了具有活性作用的外源基因人溶菌酶，而且病毒滴度为常规方法的近10倍。2、本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法制备得到的表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒对常见病原菌能够产生抑制作用。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中标记为pFastBac-AITR-LYZ的重组杆状病毒转移载体的构建思路图；图2为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中pFastBac-AITR-LYZ的酶切鉴定图；图3为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中pFastBac-AITR-LYZ的酶切鉴定图；图4为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中标记为pFastBac1-VP的重组杆状病毒转移载体的构建思路图；图5为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中pFastBac1-VP的酶切鉴定图；图6为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中pFastBac-DualI的酶切鉴定图；图7为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中pFastBac-Dual-Rep的酶切鉴定图；图8为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中标记为pFastBac-Dual-Rep的重组杆状病毒转移载体的构建思路图；图9为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中重组穿梭载体Bacmid-AITR-LYZDNA的PCR鉴定图图10为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中重组穿梭载体Bacmid-VP的PCR鉴定图；图11为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中重组穿梭载体Bacmid-Rep的PCR鉴定图；图12为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中rAAAV的Rep52基因PCR检测图；图13为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中rAAAV中LYZ的WesternBlotting检测图；图14为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中rAAAV-hLYZ的点杂交图；图15本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中rAAAV-KLKI的透射电镜图；图16为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中人溶菌酶的平板抑菌试验示意图；图17为本专利技术所述的重组禽腺联病毒的制备方法中rAAAV-hLYZ对常见菌的抑菌试验。具体实施方式下面结合附图以及实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。一、利用重组DNA技术，制备三个重组杆状病毒转移载体，分别标记为pFastBac-AITR-LYZ、pFastBac1-VP、pFastBac-Dual-Rep；利用DNA重组技术，在pAITR-KLKI、p215C3LYZ基础上，将鸡卵清蛋白基因启动子控制的人溶菌酶基因表达盒插入AAAV的左右ITR之间，获得了经酶切鉴定正确的重组载体pFastBac-AITR-LYZ，构建思路如图1所示，鉴定图如图2和图3所示，图2为pFastBac-AITR-LYZ的酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组禽腺联病毒的制备方法，其特征在于，包括：步骤一、利用重组DNA技术，制备三个重组杆状病毒转移载体，分别标记为pFastBac‑AITR‑LYZ、pFastBac1‑VP、pFastBac‑Dual‑Rep；步骤二、将所述三个重组杆状病毒转移载体分别转座于DH10Bac感受态细胞，经过筛选后使用碱裂解法提取三个重组穿梭载体质粒DNA，分别标记为Bacmid‑AITR‑LYZ、Bacmid‑VP、Bacmid‑Rep；以及步骤三、将所述三个重组穿梭载体质粒DNA同时与转染试剂PEI按照一定比例混匀后共同转染Sf9昆虫细胞，转染三天后制备产生了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒。

【技术特征摘要】
1.一种重组禽腺联病毒的制备方法，其特征在于，包括：步骤一、利用重组DNA技术，制备三个重组杆状病毒转移载体，分别标记为pFastBac-AITR-LYZ、pFastBac1-VP、pFastBac-Dual-Rep；步骤二、将所述三个重组杆状病毒转移载体分别转座于DH10Bac感受态细胞，经过筛选后使用碱裂解法提取三个重组穿梭载体质粒DNA，分别标记为Bacmid-AITR-LYZ、Bacmid-VP、Bacmid-Rep；以及步骤三、将所述三个重组穿梭载体质粒DNA同时与转染试剂PEI按照一定比例混匀后共同转染Sf9昆虫细胞，转染三天后制备产生了表达人溶菌酶的重组禽腺联病毒。2.如权利要求1所述的重组禽腺联病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述三个重组杆状病毒转移载体的制备方法为：以pAITR-KLKI、p215C3LYZ为模板将鸡卵清蛋白基因启动子控制的人溶菌酶基因表达盒插入AAAV的左右ITR之间，获得了标记为pFastBac-AITR-LYZ的重组杆状病毒转移载体；以pCR-AAAV为模板，利用PCR方法扩增翻译起始序列修饰的AAAVVP基因，插入杆状病毒表达pFastBac1载体，获得了标记为pFastBac1-VP的重组杆状病毒转移载体；将pQE-Trisy...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永娟，左伟勇，洪伟鸣，朱善元，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32