一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，该方法包括如下步骤:1)复苏293细胞并传代扩增；2)将扩增后的细胞接种于生物反应器中继续培养；3)当细胞当日葡萄糖消耗量达到70‑100克时，进行病毒接种；4)收集细胞培养物，进行冻融、离心、超滤和离子交换层析；5)检测离子交换层析洗脱液病毒颗粒浓度，并将其稀释至目标浓度。本发明专利技术方法制备的工作毒种质量稳定可靠；同时具有节省劳动力、显著提升产量的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备病毒毒种库的方法，具体地，涉及一种制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，更具体地，涉及一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法。
技术介绍
重组人5型腺病毒是利用基因工程技术删除人5型腺病毒E1B-55kD区及E3区78.3～85.8mu基因片段而获得的一种溶瘤腺病毒。由于其是一种选择复制性病毒，只在肿瘤细胞中复制，特异性杀灭肿瘤细胞，而不损害正常细胞，故其在临床研究中显示了良好的抗肿瘤疗效和安全性。在正常细胞中，E1B-55kD对腺病毒复制过程中晚期mRNA的出核起很重要的作用。当被删除后，复制过程在转录翻译阶段被打断，不能有效复制。而肿瘤细胞由于遗传的不稳定性，可以弥补E1B-55kD所起的作用，因此即使病毒删除了E1B-55kD，病毒晚期mRNA的出核不受影响，从而可以顺利的完成晚期蛋白的翻译、合成和装配。所以重组人5型腺病毒可在肿瘤细胞中选择性复制并导致肿瘤细胞的裂解，从而起到杀灭肿瘤的目的。E1B-55kD蛋白的功能是作用于正常细胞中的p53基因产物，使其失活，从而阻止p53基因诱导的宿主细胞分裂停止或细胞凋亡的发生，使病毒得以复制、繁殖。通过这种方式，人5型腺病毒可在p53基因正常的细胞中有效繁殖。而缺失了E1B-55kD基因的人5型腺病毒，由于不能产生这个蛋白来与p53基因产物作用，一旦进入细胞后，该病毒便不能有效地繁殖。在p53基因突变的细胞
中，由于p53蛋白功能的丧失，缺失E1B-55kD基因的重组人5型腺病毒可以不受抑制，在细胞中有效繁殖，进而杀死宿主细胞。因此，由于重组人5型腺病毒不能编码E1B-55kD蛋白来与细胞中的p53基因产物作用，使得重组人5型腺病毒在p53+或p53－的细胞中的繁殖能力具有显著差别。重组人5型腺病毒在p53－细胞中的繁殖能力要比其在p53基因正常细胞中高约100倍。这样就造成了重组人5型腺病毒在p53－的细胞中特异性生长。如前所述，很多人体肿瘤细胞p53基因产生突变，重组人5型腺病毒对这些肿瘤可以产生特异性杀伤。这种杀伤性质上属于病毒对细胞所能产生的杀伤作用。重组人5型腺病毒基因中另一删除区E3区78.3～85.8mu基因片段。此段基因删除后，重组人5型腺病毒对抗机体免疫清除机制的能力大为降低，在正常细胞内存在时间缩短。因此，重组人5型腺病毒在体内的安全性明显提高。制备重组人5型腺病毒毒种的技术难点主要集中在两个方面：(1)哺乳动物细胞大规模培养上，尽可能多的为腺病毒扩增提供优质宿主细胞；(2)腺病毒在宿主细胞中的大规模增殖。通过利用生物反应器来制备毒种库，可解决这两方面的技术难点。重组人5型腺病毒(安柯瑞)作为有效的载体近年来越来越多地被用于基因治疗的研究,工作毒种是制备重组人5型腺病毒(安柯瑞)的首要条件,原工作毒种制备主要采用细胞瓶，以293细胞为宿主细胞，待宿主细胞扩增至一定数量后，以主毒种感染293细胞，培养收获细胞培养物即为安柯瑞工作种子批，工作种子批用于制备安柯瑞原液。现有细胞瓶法的缺点为劳动强度大，耗时耗力，产量很低，导致几乎每2年就必须制备安柯瑞工作毒种；并且收获的细胞培养物中含有大量的宿主蛋白和核酸，导致收获液无法进行无菌过滤，这对制备的环境和操作提出了巨大的挑战。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，解决现有细胞瓶法劳动强度大，耗时耗力，产量低的问题。同时本专利技术还解决收获的细胞培养物中含有大量的宿主蛋白和核酸，导致收获液无法进行无菌过滤，这对制备的环境和操作提出了巨大的挑战的问题。为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，该方法包括如下步骤:1)复苏293细胞并传代扩增；2)将扩增后的细胞接种于生物反应器中继续培养；3)当细胞当日葡萄糖消耗量达到70-100克时，进行病毒接种；4)收集细胞培养物，进行冻融、离心、超滤和离子交换层析；5)检测离子交换层析洗脱液病毒颗粒浓度，并将其稀释至目标浓度。优选地，步骤2)的具体方法如下：每瓶细胞倾去细胞培养液后加入消化液进行消化，消化完全后加入完全培养基终止消化，制成细胞悬浮液，合并细胞悬浮液入接种瓶内；将细胞悬浮液接种于已加入新的完全培养液的生物反应器中继续培养，接入细胞总量在109个以上；细胞接入后每日取样，测培养液的葡萄糖浓度；细胞处于对数生长期后，细胞代谢产物可能使生物反应器内完全培养液pH值下降，系统自动补加碳酸氢钠溶液调控生物反应器内pH值。优选地，步骤3)的具体方法如下：当细胞当日葡萄糖消耗量达到70～100克时，打空生物反应器内的完全培养液，将病毒种子液接入生物反应器内，并
补加接毒培养液进行病毒接种；接入量不低于1E13TCID50；接毒8小时后恢复灌注接毒培养液，每天的灌注量根据细胞培养阶段的灌注量进行灌注。优选地，步骤4)的具体方法如下：接毒48-120小时后收获细胞培养物，-20℃以下至室温反复冻融2-4次，并对其进行离心，丢弃细胞碎片，收集上清液；对上清液进行浓缩和洗滤；离子交换层析，收集病毒峰，病毒峰在OD260不低于300mAU时开始收集，持续收集至吸收值下降，吸收值低于600mAU时放弃收集。优选地，步骤5)的具体方法如下：检测离子交换层析洗脱液病毒颗粒浓度，用含5％胎牛血清的DMEM低糖培养基将其稀释至目标浓度，作为生产用毒种。优选地，步骤2)的细胞培养设定的参数为：培养温度35-38℃、pH值7.0-7.6、溶氧30-60％、转速90-150rpm、模式为灌注模式。优选地，步骤3)的病毒培养设定的参数为：病毒培养温度在34-36℃，pH值7.0-7.6、溶氧30-60％、转速90-150rpm、模式为灌注模式。优选地，步骤2)接入细胞悬浮液之前，先将细胞贴壁载体和PBS缓冲溶液装入生物反应器中，检查生物反应器是否正常工作；再将生物反应器放入灭菌锅内121℃灭菌90分钟。优选地，步骤2)生物反应器灭菌后放空PBS缓冲溶液，接入完全培养液，在37℃环境中试运行，至细胞上罐；试运行期间检菌培养时间必须大于48小时。优选地，步骤2)中由测得的葡萄糖浓度计算每日糖耗，以糖耗值作为细胞生长状态的指标；细胞上罐后第2天开始灌注，设定灌注体积为2L/天，第3天则根据每日糖耗来调节完全培养液的灌注量，使培养罐内培养液的残糖值控制在1±0.5g/L。优选地，完全培养液的配方：碳酸氢钠3.7g/L、DMEM(高糖)粉13.48g/L、
已灭活的胎牛血清100ml/L；所述接毒培养液的配方为：碳酸氢钠3.7g/L、DMEM(高糖)粉13.48g/L、已灭活的胎牛血清50ml/L。本专利技术的优点和有益效果在于：本专利技术提供一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：(1)用生物反应器法代替细胞瓶法制备工作毒种，可解决劳动强度大，耗时耗力的问题，操作人员相对于细胞瓶法减少了一半，生产周期也缩短了25％；(2)利用生物反应器来制备工作毒种，并且对生物反应器收获的细胞培养物进行纯化，去除其中大量的核酸和蛋白，使得培养物可以进行无菌过滤处理，制备出的工作本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:1)复苏293细胞并传代扩增；2)将扩增后的细胞接种于生物反应器中继续培养；3)当细胞当日葡萄糖消耗量达到70‑100克时，进行病毒接种；4)收集细胞培养物，进行冻融、离心、超滤和离子交换层析；5)检测离子交换层析洗脱液病毒颗粒浓度，并将其稀释至目标浓度。

【技术特征摘要】
1.一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:1)复苏293细胞并传代扩增；2)将扩增后的细胞接种于生物反应器中继续培养；3)当细胞当日葡萄糖消耗量达到70-100克时，进行病毒接种；4)收集细胞培养物，进行冻融、离心、超滤和离子交换层析；5)检测离子交换层析洗脱液病毒颗粒浓度，并将其稀释至目标浓度。2.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，其特征在于，所述步骤2)的具体方法如下：每瓶细胞倾去细胞培养液后加入消化液进行消化，消化完全后加入完全培养基终止消化，制成细胞悬浮液，合并细胞悬浮液入接种瓶内；将细胞悬浮液接种于已加入新的完全培养液的生物反应器中继续培养，接入细胞总量在109个以上；细胞接入后每日取样，测培养液的葡萄糖浓度；细胞处于对数生长期后，细胞代谢产物可能使生物反应器内完全培养液pH值下降，系统自动补加碳酸氢钠溶液调控生物反应器内pH值。3.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，其特征在于，所述步骤3)的具体方法如下：当细胞当日葡萄糖消耗量达到70-100克时，打空生物反应器内的完全培养液，将病毒种子液接入生物反应器内，并补加接毒培养液进行病毒接种；接入量不低于1E13TCID50；接毒8小时后恢复灌注接毒培养液，每天的灌注量根据细胞培养阶段的灌注量进行灌注。4.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，其特征在于，所述步骤4)的具体方法如下：接毒48-120小时后收获细胞培养物，-20℃以下至室温反复冻融2-4次，并对其进行离心，丢弃细胞碎片，收集上清液；对上清液进行浓缩和洗滤；离子交换层析，收集病毒峰，
\t病毒峰在OD260不低于300mAU时开始收集，持续收集至吸收值下降，吸收值低于6...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅晖，刘建飞，郑剑，岑仡，王爱霞，任素贤，
申请(专利权)人：上海三维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31