一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，该方法包括如下步骤:1)复苏293细胞并传代扩增；2)将扩增后的细胞接种于生物反应器中继续培养；3)当细胞当日葡萄糖消耗量达到70‑100克时，进行病毒接种；4)收集细胞培养物，进行冻融、离心、超滤和离子交换层析；5)检测离子交换层析洗脱液病毒颗粒浓度，并将其稀释至目标浓度。本发明专利技术方法制备的工作毒种质量稳定可靠；同时具有节省劳动力、显著提升产量的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备病毒毒种库的方法，具体地，涉及一种制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，更具体地，涉及一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法。
技术介绍
重组人5型腺病毒是利用基因工程技术删除人5型腺病毒E1B-55kD区及E3区78.3～85.8mu基因片段而获得的一种溶瘤腺病毒。由于其是一种选择复制性病毒，只在肿瘤细胞中复制，特异性杀灭肿瘤细胞，而不损害正常细胞，故其在临床研究中显示了良好的抗肿瘤疗效和安全性。在正常细胞中，E1B-55kD对腺病毒复制过程中晚期mRNA的出核起很重要的作用。当被删除后，复制过程在转录翻译阶段被打断，不能有效复制。而肿瘤细胞由于遗传的不稳定性，可以弥补E1B-55kD所起的作用，因此即使病毒删除了E1B-55kD，病毒晚期mRNA的出核不受影响，从而可以顺利的完成晚期蛋白的翻译、合成和装配。所以重组人5型腺病毒可在肿瘤细胞中选择性复制并导致肿瘤细胞的裂解，从而起到杀灭肿瘤的目的。E1B-55kD蛋白的功能是作用于正常细胞中的p53基因产物，使其失活，从而阻止p53基因诱导的宿主细胞分裂停止或细胞凋亡的发生，使病毒得以复制、繁殖。通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:1)复苏293细胞并传代扩增；2)将扩增后的细胞接种于生物反应器中继续培养；3)当细胞当日葡萄糖消耗量达到70‑100克时，进行病毒接种；4)收集细胞培养物，进行冻融、离心、超滤和离子交换层析；5)检测离子交换层析洗脱液病毒颗粒浓度，并将其稀释至目标浓度。

【技术特征摘要】
1.一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:1)复苏293细胞并传代扩增；2)将扩增后的细胞接种于生物反应器中继续培养；3)当细胞当日葡萄糖消耗量达到70-100克时，进行病毒接种；4)收集细胞培养物，进行冻融、离心、超滤和离子交换层析；5)检测离子交换层析洗脱液病毒颗粒浓度，并将其稀释至目标浓度。2.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，其特征在于，所述步骤2)的具体方法如下：每瓶细胞倾去细胞培养液后加入消化液进行消化，消化完全后加入完全培养基终止消化，制成细胞悬浮液，合并细胞悬浮液入接种瓶内；将细胞悬浮液接种于已加入新的完全培养液的生物反应器中继续培养，接入细胞总量在109个以上；细胞接入后每日取样，测培养液的葡萄糖浓度；细胞处于对数生长期后，细胞代谢产物可能使生物反应器内完全培养液pH值下降，系统自动补加碳酸氢钠溶液调控生物反应器内pH值。3.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，其特征在于，所述步骤3)的具体方法如下：当细胞当日葡萄糖消耗量达到70-100克时，打空生物反应器内的完全培养液，将病毒种子液接入生物反应器内，并补加接毒培养液进行病毒接种；接入量不低于1E13TCID50；接毒8小时后恢复灌注接毒培养液，每天的灌注量根据细胞培养阶段的灌注量进行灌注。4.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备重组人5型腺病毒毒种库的方法，其特征在于，所述步骤4)的具体方法如下：接毒48-120小时后收获细胞培养物，-20℃以下至室温反复冻融2-4次，并对其进行离心，丢弃细胞碎片，收集上清液；对上清液进行浓缩和洗滤；离子交换层析，收集病毒峰，
\t病毒峰在OD260不低于300mAU时开始收集，持续收集至吸收值下降，吸收值低于6...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅晖，刘建飞，郑剑，岑仡，王爱霞，任素贤，
申请(专利权)人：上海三维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31