重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法，所述四价重组腺病毒疫苗，包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株。本发明专利技术首先通过制备包含不同六邻体基因片段在内的重组穿梭质粒，与重组人3型腺病毒基因组进行细菌内同源重组，获得六邻体基因片段被替换为7型、14型、55型的重组腺病毒基因组，转染细胞后拯救得到主要衣壳蛋白‑六邻体蛋白不同的重组人3型、7型、14型、55型重组腺病毒。纯化后按相同蛋白质含量混合，再用β‑内丙脂进行灭活，得到四价腺病毒疫苗，该四价腺病毒疫苗可以诱导出对四种血清型腺病毒的中和抗体应答，中和效价均为500‑1000。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种重组腺病毒、以及以人3型腺病毒(HAdv3)为载体的四价人腺病毒疫苗及其制备方法。
技术介绍
人腺病毒(humanAdenovirus,HAdV)是1953年首次从急性呼吸道疾病病人身上分离、鉴定出来的一类病原体，可以感染人类呼吸道、胃肠道、泌尿系统或眼部等多种组织，导致急性呼吸道感染(ARI)、急性胃肠炎、肾炎、眼角膜结膜炎等多种不同疾病。腺病毒流行广泛，传播快，近年来在多个国家和地区时有爆发和流行，严重威胁到社会公共卫生安全。腺病毒感染的患者主要是婴幼儿及体弱人群，在人员密集的幼儿园、军队院校、新兵训练营中腺病毒暴发流行时有发生，特别是其感染导致的重症肺炎病死率高。腺病毒引起的肺炎尤为严重，不仅可以引起心力衰竭、呼吸衰竭，还可以引起肺外受累，如脑炎、肝损害、心肌炎或心肌损害等，甚至导致死亡，而且通常预后较差。腺病毒型别多，至今已发现的人腺病毒有7组50多种血清型，超过68种基因型。B组、C组、E组腺病毒都可以引起呼吸道感染，其中B组人3、7、14、55、11型及E组4型腺病毒是严重的呼吸道疾病如急性呼吸道感染和婴幼儿致死性肺炎的重要病原体，传染性强，在国内外多有报道。腺病毒感染在我国也非常普遍，腺病毒肺炎是我国发病率名位前列的病毒性肺炎之一，患者年龄主要分布主要在6个月至三岁之间。在我国，腺病毒的地方性流行暴发时有发生，导致呼吸道感染的腺病毒主要是腺病毒3型和7型，其中腺病毒3型检出最多，近年来55型成为一种重要的流行株，而B组14型、11型，C组2型、5型、1型，E组4型等型别的腺病毒呼吸道感染也时有报道，但相对较少，近十年来国内基本上没有报告4型腺病毒的流行。因此，在致婴幼儿和成人急性呼吸道感染ARI的腺病毒中，人腺病毒B组3型、7型、14型和55型是最重要的几个型别。其中3型腺病毒主要导致婴幼儿严重感染，一般不导致成年人严重感染。相对其它型别的腺病毒感染，B组人7型腺病毒(HAdV-B7)、人55型(HAdV-B55)感染引起的肺炎症状通常更严重。国内从60年代以来一直有HAdV-B7重症感染和爆发流行的报道。近年来新出现的HAdV-B55腺病毒导致的呼吸道感染和严重肺炎暴发流行的报道越来越多，在全国范围内在人群密集的军营和高校已有多起爆发流行，已经成为重要的流行病毒株，引起人们更多重视。人腺病毒14型(HAdV-B14)引起的幼儿和成人急性呼吸道感染在国内外都有过爆发病例报道，并且常常导致重症肺炎，特别是近年来出现的高致病的HAdV-14p1株的流行严重威胁公众健康。HAdV-B55是一种基因组重组的腺病毒，其基因组包括纤毛基因主要来自14型腺病毒，只有六邻体高变区来源于人11型腺病毒，这种重组变异导致其不能被HAdV-B14抗血清中和。重组是腺病毒进化的主要方式，重组可能产生生物学特性改变的新型腺病毒，出现更强致病性或更强传染性的新毒株，将会严重威胁人类健康。腺病毒致病的广泛性和危害的严重性使得腺病毒的防治显得十分重要，接种腺病毒疫苗是预防腺病毒感染最有效的方法之一。但由于腺病毒产生的中和抗体只能中和同型腺病毒的感染，不同型别腺病毒抗体之间无交叉保护作用。在我国，腺病毒疫苗的临床使用还是一片空白。从我国近年来多次爆发腺病毒疫情来看，自主研发腺病毒疫苗十分必要。若研制出一种能同时预防几种型别的腺病毒感染的疫苗对于降低腺病毒感染率将非常有价值。而不同型别腺病毒简单混合的多价疫苗可能体内重组产生高致病的病毒而受到限制。腺病毒颗粒是一个二十面体的对称结构，壳体由12个位于顶角的五邻体基座和纤维蛋白，240个非顶角颗粒的六邻体(hexon)以及结构辅助蛋白多肽构成。六邻体是三聚体结构，包括是腺病毒颗粒中最丰富的免疫原，是腺病毒最主要的诱导中和性抗体的抗原。不同型别腺病毒的六邻体蛋白的氨基酸序列有高达78-95％的同源性，其区别主要集中在7个高变区(HVRs)，这些高变区暴露于病毒壳体表面，不涉及六邻体单体间的相互作用，也不与其它的腺病毒蛋白相互作用。不同型别腺病毒的六邻体可能可以交换而不影响其复制和增殖。常规的多价疫苗制备方法为分离不同型别的临床毒株，分别培养纯化，合适比例配伍后制成多价疫苗，但这种方法制备多价腺病毒疫苗有其缺陷，首先，不同型别腺病毒基因组间易发生重组，可能产生毒力更强的新型腺病毒；其次，不同型别腺病毒的复制增殖效率不同，导致研制多价疫苗时配伍困难。目前国际上人腺病毒疫苗只有人4型、7型腺病毒疫苗，这两种疫苗为活的口服肠溶型疫苗，仅在美国军队的新兵训练营中使用，其应用显著减少了美军发热性呼吸道感染的发病率。但是这种疫苗只能预防人4型、7型腺病毒感染，对其它广泛流行的型别如3型、14型和55型没有预防作用。因此，有必要研制一种多价腺病毒疫苗，可以预防常见的腺病毒型别感染。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种重组腺病毒、四价重组腺病毒疫苗及其制备方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种重组腺病毒，其六邻体具有如SEQIDNo:3、SEQIDNo:4、SEQIDNo:5、或SEQIDNo:6所示的碱基序列。一种四价重组腺病毒疫苗，其包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株，所述重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株的六邻体分别具有如SEQIDNo:3、SEQIDNo:4、SEQIDNo:5、SEQIDNo:6所示的碱基序列。一种四价重组腺病毒疫苗，其包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株，所述重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株的六邻体分别具有如SEQIDNo:7、SEQIDNo:8、SEQIDNo:9、SEQIDNo:10所示的氨基酸序列。在其中一些实施例中，所述疫苗中重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株和重组55型腺病毒株的病毒颗粒数之比为1：1：1：1。在其中一些实施例中，所述疫苗对3型、7型、14型和55型腺病毒的中和效价均为500-1000。在其中一些实施例中，所述1ml疫苗中含有的病毒颗粒数为1012vps。本专利技术还提供了上述四价重组腺病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)、利用ClaI+BamHI双酶切穿梭质粒pBRHexonL/R和腺病毒Ad7、Ad14和Ad55的六邻体基因，连接，转化，分别获得腺病毒Ad7、Ad14和Ad55的穿梭质粒H7-pBRH3S、H14-pBRH3S和H55-pBRH3S；所述腺病毒Ad7、Ad14和Ad55的六邻体基因分别具有如SEQIDNo:4、SEQIDNo:5和SEQIDNo:6所示的碱基序列；(2)、用AvRII+PacI双酶切骨架质粒pBRAd△E3GFP使之线性化，凝胶回收纯化大片段；用EcoRI+SalI分别双酶切步骤(1)的穿梭质粒H7-pBRH3S、H14-pBRH3S和H55-pBRH3S，将线性化的骨架质粒的大片段和经双酶切的穿梭质粒共电转化细菌BJ5183，获得重组质粒，再经AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，拯救包装，得到重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺病毒，其特征在于，其六邻体具有如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、或SEQ ID No:6所示的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组腺病毒，其特征在于，其六邻体具有如SEQIDNo:3、SEQIDNo:4、SEQIDNo:5、或SEQIDNo:6所示的碱基序列。2.一种四价重组腺病毒疫苗，其特征在于，其包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株，所述重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株的六邻体分别具有如SEQIDNo:3、SEQIDNo:4、SEQIDNo:5、SEQIDNo:6所示的碱基序列。3.一种四价重组腺病毒疫苗，其特征在于，其包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株，所述重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株的六邻体分别具有如SEQIDNo:7、SEQIDNo:8、SEQIDNo:9、SEQIDNo:10所示的氨基酸序列。4.根据权利要求2或3所述的四价重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗中重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株和重组55型腺病毒株的病毒颗粒数比为1：1：1：1。5.根据权利要求2或3所述的四价重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗对3型、7型、14型和55型腺病毒的中和效价均为500-1000。6.根据权利要求2或3所述的四价重组腺病毒疫苗，其特征在于，1ml疫苗中含有的病毒颗粒数为1012vps。7.权利要求2-...

【专利技术属性】
技术研发人员：田新贵，周荣，蒋再学，马强，李潇，周志超，
申请(专利权)人：广州呼研所医药科技有限公司，广州呼吸疾病研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44