HPV18的重组腺相关病毒疫苗及其制备方法技术

HPV18的重组腺相关病毒疫苗及其制备方法属于生物医药技术领域。本发明专利技术提供一种优化型的编码HPV18型(HPV18)主要衣壳蛋白L1的基因序列，以及含有其的2/1型重组腺相关病毒疫苗并提供了制备上述重组腺相关病毒的方法。本发明专利技术提供的重组HPV18L1的2/1型重组腺相关病毒疫苗可用于制备治疗和预防食管癌及宫颈癌的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
本专利技术涉及一种含密码子优化型HPV18L1基因的2/1型重组腺相关病毒疫苗及其制备方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）是一种在自然界广泛存在的嗜上皮性病毒，属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属的无包膜闭环双链DNA病毒。20世纪70年代，Zur Hausen提出HPV是宫颈癌的病毒学成因，之后国内外学者就两者之间的关系进行了大量研究并提出90%以上的宫颈癌是由于HPV感染引起，国际癌症研究协会(IARC)发表的研究显示超过2/3的子宫颈癌病例与HPV16型(51％)或HPV18型(16.2％)感染有关。1982年syrjane的研究表明HPV和食管鳞癌之间存在相关性，之后的不少研究也证实了这一观点（Shen ZY，Xu LY，Li EM，et al.The multistage process ofcarcinogenesis in human esophageal epithelial cells induced byhuman papillomavirus.Oncol Rep，2004，11：647-54.）其中曲鹏，李劲涛的研究也表明HPV感染可能是食管鳞癌的病毒学诱因，结果显示标本HPV感染率为82.6％，其中HPV16型感染率34.8％，HPV18型感染率34.8。（安阳地区不同食管鳞癌标本HPV感染率的比较研究，曲鹏，李劲涛）。全球范围内子宫颈癌是第二大常见的妇科恶性肿瘤，每年约有50万新增子宫颈癌病例，28万的死亡病例，我国每年新增宫颈癌病例约13.5万，占全球发病数量的l／3，约8万人死亡。食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。男多于女，发病年龄多在40岁以上。根据HPV与良性和恶性肿瘤的相关度，将HPV病毒分为低危型和高危型两种。其中低危型包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81等，高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59等。HPV基因组L区的L1作为HPV的主要衣壳蛋白能够单独或与次要衣壳蛋白L2共同在体外自行组装成VLPs。已经上市并广为接种的两种针对HPV预防性疫苗，Merck公司的HPV6、11、16、18四价VLP Gardasil疫苗和GSK公司研制的HPV16、18双价VLP Cervarix疫苗，都是由HPV L1蛋白组装成的VLPs。其作用机理是以VLP三作为靶抗原诱导机体产生特异性中和抗体达到预防相应型别HPV的感染。AAV属细小病毒科,为一缺陷病毒,是正链或负链单链DNA病毒,外包二十面体衣壳蛋白,病毒颗粒的直径在20～26nm之间。AAV的复制依赖于辅助病毒(helper virus)，如腺病毒或疱疹病毒。野生型AAV2(wtAAV2)基因组为线性单链DNA，大小约4.7kb。两末端各含一个倒置末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，中间含有rep和cap基因。Xiao等（1998）将腺病毒上起辅助功能的基因全部构建到一个新的质粒上，由质粒代替腺病毒向rAAV2提供辅助功能，从而构建了重组II型AAV载体（rAAV2），它具有长时程有效表达外源基因、无致病性、免疫原性弱和基因定点整合等多项优点。重组2/1型AAV(rAAV2/1)是近年来出现的新型载体,采用AAV2的ITR,而仅将AAV2的外壳蛋白基因置换成AAV1的外壳蛋白基因，它在保持II型AAV载体高效表达外源基因、高安全性等优点的同时提供了更好的肌纤维细胞嗜性，是目前基因治疗领域中倍受瞩目的载体之一。HPV18L1基因相对E6，E7癌基因而言更安全，且L1编码的蛋白能诱导产生较高的体液免疫和细胞免疫效果，而2/1型重组腺相关病毒（rAAV2/1）也具有长时程有效表达外源基因、无致病性等有点，因此可以开发制备防治食管癌和宫颈癌的基于HPV18L1的重组腺相关病毒疫苗。
技术实现思路
本专利技术提供了一种密码子优化型的编码HPV18主要衣壳蛋白L1的基因序列以及一种含有上述优化型基因的2/1型重组腺相关病毒（rAAV2/1）。一种制备所述2/1型重组腺相关病毒（rAAV2/1）的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列克隆到重组腺相关病毒穿梭质粒中，得到重组腺相关病毒穿梭质粒；（2）用步骤（1）制备的重组腺相关穿梭质粒和pHelper质粒、P5E18RXC1质粒共转染腺相关病毒包装细胞，得到含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的2/1型重组腺相关病毒（rAAV2/1）。进一步，所述重组腺相关病毒穿梭质粒是质粒pAAV-MCS。进一步，所述重组腺相关病毒包装细胞是293ft细胞。进一步，三质粒采用quickshuttle转染试剂按照摩尔比1:1:1的比值进行三质粒共转染。进一步，所述疫苗的成分为所述的2/1型重组腺相关病毒。进一步包括，所述基因在制备用于防治HPV引起的子宫颈癌的药物或疫苗组合物中的用途。进一步包括，所述基因在制备用于防治HPV引起的食管癌的药物或疫苗组合物中的用途。进一步包括，所述的重组腺相关病毒疫苗在制备用于预防和/或治疗宫颈癌药物或疫苗组合物中的用途。进一步包括，所述的重组腺相关病毒疫苗在制备用于预防和/或治疗食管癌方面的药物或疫苗组合物中的用途。本专利技术更进一步提供一种HPV18的2/1型重组腺相关病毒疫苗，其有效成分为上述2/1型重组腺相关病毒。本专利技术提供的HPV18的2/1型重组腺相关病毒可用于制备治疗和预防子宫颈癌和食管癌的药物。本专利技术实现的技术效果如下：本专利技术提供的HPV18的2/1型重组腺相关病毒，用于制备HPV18的2/1型重组腺相关病毒疫苗，产生中和抗体的滴度明显提高，细胞免疫效果也显著加强。附图说明图1.AAV-MCS-HPV18L1重组质粒HindIII，EorlⅠ双酶切电泳1.DNAmarker120002.MCS-HPV8L1质粒13.MCS-HPV8L1质粒24.MCS-HPV8L1质粒35.MCS-HPV8L1质粒46.MCS-HPV8L1质粒5图2.腺相关病毒颗粒的电镜图图3.rAAV2/1-HPV18L1疫苗诱导的本文档来自技高网...

【技术保护点】
HPV18的2/1型重组腺相关病毒，其特征在于，所述病毒含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.HPV18的2/1型重组腺相关病毒，其特征在于，所述病毒含有
SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一种制备权利要求1所述2/1型重组腺相关病毒的方法，其
特征在于，包括如下步骤：
（1）将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列克隆到重组腺相关病毒
穿梭质粒中，得到重组腺相关病毒穿梭质粒；
（2）用步骤（1）制备的重组腺相关穿梭质粒和pHelper质粒、
P5E18RXC1质粒共转染腺相关病毒包装细胞，得到含有SEQ ID NO:1
所示的核苷酸序列的2/1型重组腺相关病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组腺相关病
毒穿梭质粒是质粒pAAV-MCS。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组腺相关病
毒包装...

【专利技术属性】
技术研发人员：周玉柏，曾毅，刘海庭，方军，沈思嗣，李劲涛，李泽琳，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11