一种日本血吸虫病疫苗联合免疫方法及应用技术

本发明专利技术提供一种日本血吸虫病疫苗联合免疫方法及应用，属于血吸虫病防治领域。该免疫方案中首先采用含优化后日本血吸虫磷酸丙糖异构酶基因(SjTPI.opt)的重组腺病毒疫苗(rAdV-SjTPI.opt)经肌肉途径进行初次免疫，再用重组蛋白蛋白疫苗(rSjTPI)经皮下途径进行加强免疫，免疫间隔时间为2周。该免疫方案具有预防日本血吸虫感染的效果，免疫动物后可诱导宿主产生较高水平的体液、细胞免疫应答，保护力可到达70％的水平。同时该方案中，两种疫苗制备简单、免疫操作方便，具备良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种日本血吸虫病疫苗联合免疫方法及应用，属于血吸虫病防治领域。该免疫方案中首先采用含优化后日本血吸虫磷酸丙糖异构酶基因(SjTPI.opt)的重组腺病毒疫苗(rAdV-SjTPI.opt)经肌肉途径进行初次免疫，再用重组蛋白蛋白疫苗(rSjTPI)经皮下途径进行加强免疫，免疫间隔时间为2周。该免疫方案具有预防日本血吸虫感染的效果，免疫动物后可诱导宿主产生较高水平的体液、细胞免疫应答，保护力可到达70％的水平。同时该方案中，两种疫苗制备简单、免疫操作方便，具备良好的应用前景。【专利说明】一种日本血吸虫病疫苗联合免疫方法及应用
本专利技术涉及血吸虫病防治领域，特别涉及一种日本血吸虫病疫苗联合免疫方法及 应用。
技术介绍
血吸虫病是一种危害严重的被忽视热带病。截至2011年，血吸虫病仍流行于全球 的78个国家和地区，感染人口达2. 43亿，有约7. 79亿人受到该病的威胁。感染人体的血吸 虫主要包括埃及血吸虫、曼氏血吸虫、间插血吸虫、日本血吸虫及湄公血吸虫，而我国是日 本血吸虫病危害最严重的国家。经过多年积极有效的科学防治，血吸虫病流行区被压缩在 了湖区的湖南、湖北、江西、安徽、江苏以及大山区的云南、四川等省份，但由于日本血吸虫 自然保虫宿主多、中间宿主--钉螺分布广且难以完全消灭、流行区地理条件复杂等因素， 给我国血吸虫病的进一步防治造成了很大的困难。截至2012年底，我国仍有血吸虫病人约 24. 06万例，流行区受感染威胁的存栏耕牛数达119万头。因此，血吸虫病在我国的流行形 势仍然十分严峻。 传染性疾病控制经验显示，疫苗是目前人类可以彻底控制某一传染病的关键武 器，具有长效、安全、经济等优势。如有可能研发高效的血吸虫病疫苗，将可有助于进一步控 制血吸虫病。鉴于血吸虫在其终末宿主体内不繁殖，减少感染后宿主体内的成虫及虫卵负 荷，就可有效地减轻血吸虫虫卵对宿主肝脏造成的免疫病理损伤，减少血吸虫虫卵对环境 的污染，降低血吸虫病传播的风险。因此，世界卫生组织提出，如果一种疫苗可使宿主体内 的虫荷下降50%，就可有效控制血吸虫病的传播。近年来，日本血吸虫病疫苗进行了较多的 研究，动物模型中发现，仅可诱导部分免疫保护作用，减虫率低于或不能稳定的达到50%， 因此，如何进一步提高疫苗的免疫保护作用，是血吸虫病疫苗研究的关键。 近年来研究发现，采用不同种疫苗进行联合免疫的方案可显著提高疫苗的免疫保 护效果，显示了广泛的应用前景。该方案中不同种疫苗均针对同一个保护性抗原分子，但采 用不同的疫苗形式或载体，常见的有DNA疫苗初次免疫一蛋白疫苗加强免疫、两种不同病 毒载体疫苗进行联合免疫等。在血吸虫病疫苗研究中，仅见有DNA疫苗和蛋白疫苗联合免 疫、口服疫苗和蛋白疫苗联合免疫的报道。而本专利技术中的免疫方案在血吸虫病疫苗研究领 域还未见报道。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的之一在于提供一种日本血吸虫病 疫苗联合免疫方法及应用，该方法中初次及加强免疫的疫苗分别为重组腺病毒疫苗及重组 蛋白疫苗，针对的保护性抗原均为日本血吸虫磷酸丙糖异构酶分子；该专利技术方法首次建立 了以重组腺病毒疫苗初次免疫一重组蛋白疫苗加强免疫的联合免疫方案，为血吸虫病的防 治提供了一种新型、高效的策略。该方案中两种疫苗免疫动物后具有较高的安全性，且可诱 导动物产生较高水平的体液、细胞免疫应答，保护力可到达70%的水平。同时该方案中，两 种疫苗制备简单、免疫操作方便，因此具备良好的应用前景。 为达到上述目的，本专利技术的技术方案： -种日本血吸虫病疫苗联合免疫方法，采用含保护性抗原的重组腺病毒疫苗和重 组蛋白疫苗分别进行初次免疫和加强免疫，联合免疫方案为V+V+V+P ; 所述的保护性抗原基因为密码子优化后的日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构 酶基因 SjTPI. opt ; 所述的重组腺病毒疫苗为rAdV-SjTPI. opt，载体为E1、E3联合缺失的复制缺陷型 人5型腺病毒Ad5 ; 所述的重组蛋白疫苗为原核表达纯化获得的rSjTPI与福氏完全佐剂的乳化物。 进一步的，所述的重组腺病毒疫苗的免疫途径为肌肉免疫途径，每次的免疫剂量 为 5*109pfu/kg 体重； 所述的重组蛋白疫苗的免疫途径为皮下免疫途径,每次的免疫剂量为5mg/kg体 重； 进一步的，所述的免疫方案中的免疫间隔时间为2周。 上述任一所述的疫苗联合免疫方法在血吸虫病防治中的应用。其具有预防日本血 吸虫感染的效果，该免疫方案免疫动物后，能够诱导宿主产生较高水平的体液及细胞免疫 应答，保护力可达到70%的水平。 相对于现有技术，本专利技术的有益效果为： 本专利技术首次建立了以重组腺病毒疫苗初次免疫一重组蛋白疫苗加强免疫的联合 免疫方案，为血吸虫病的防治提供了一种新型、高效的策略。该方案中两种疫苗免疫动物后 具有较高的安全性，且可诱导动物产生较高水平的体液、细胞免疫应答，保护力可到达70% 的水平。同时该方案中，两种疫苗制备简单、免疫操作方便，因此具备良好的应用前景。 【专利附图】【附图说明】 图1各组小鼠诱导产生的特异性IgG应答检测结果，其中A为IgG检测结果；B为 IgG滴度结果；C为IgG亚类检测结果；D为IgG亲和力结果； 图2各组小鼠脾细胞培养上清中各种细胞因子检测结果，其中，A为IL-2、B为 IFN-γ、C为TNF，D为IL-6、E为IL-KKF为IL-17A，mock为未进行刺激的检测结果；rSjTPI 为特异性蛋白刺激的检测结果； 图3各组小鼠感染后肝脏中单个虫卵肉芽肿面积结果。 图4为保护性抗原基因序列（SjTPI. opt)。 【具体实施方式】 下面结合附图及【具体实施方式】对本专利技术技术方案做进一步详细描述： 试验例： 1、疫苗制备 重组腺病毒疫苗（rAdV-SjTPI. opt)构建及制备 重组腺病毒疫苗制备方法： 重组腺病毒的构建 (I)SjTPI. opt基因的扩增及穿梭载体的构建以实验室前期构建并保存的质粒 pcDNA3. 1-SjTPI. opt 为模板，根据 SjTPI. opt 基因序列，用软件Primer Premier5. 0 设ii 对引物，在引物的5'端分别引入Sail和XhoI酶切位点： P1:5，-GTCGACATGAGCAGCAGCCGGAAGTTC P2:5，-CTCGAGTCACTGCCGGGCCTTGCAGAT 以Pl和P2为上下游引物扩增出了 SjTPI. opt的全基因序列，大小为759bp，通过 双酶切将该基因克隆入穿梭载体PShuttle-CMV中，经酶切及PCR鉴定后获得含SjTPI基因 的穿梭质粒 pShuttle-CMV/SjTPI. opt ; (2)含SjTPI基因的穿梭载体（PShuttle-CMV)与腺病毒骨架载体（pAdEasy-1)同 源重组鉴定好的上述穿梭质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι经电转化方 法转化入大肠杆菌BJ5183,并发生同源重组，经100 μ g/ml卡那霉素筛选及酶切鉴定获得 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种日本血吸虫病疫苗联合免疫方法，其特征在于，采用含保护性抗原的重组腺病毒疫苗和重组蛋白疫苗分别进行初次免疫和加强免疫，联合免疫方案为V+V+V+P；所述的保护性抗原基因为密码子优化后的日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶基因SjTPI.opt；所述的重组腺病毒疫苗为rAdV‑SjTPI.opt，载体为E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒Ad5；所述的重组蛋白疫苗为原核表达纯化获得的rSjTPI与福氏完全佐剂的乳化物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴洋，王晓婷，赵松，唐建霞，
申请(专利权)人：江苏省血吸虫病防治研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32