一种青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫microRNA的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫microRNA的检测方法，通过Solexa高通量测序技术鉴定与青蒿琥酯作用相关的microRNA。本发明专利技术首次鉴定了青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫的相关microRNA，为深入研究microRNA在青蒿琥酯抗日本血吸虫中的作用机制奠定基础，为新药的研发提供潜在的药物靶点。

【技术实现步骤摘要】
一种青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫microRNA的检测方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫microRNA的检测方法。
技术介绍
血吸虫病是一种由寄生在肠系膜门静脉系统的裂体吸虫引起的感染性疾病，是七大被忽视的热带病之一，给热带和亚热带逾76个国家和地区带来了严重的公共卫生学问题。目前，中国约有24万人罹患血吸虫病，因此，该病依然是中国亟待解决的一个重要公共卫生问题。从20世纪90年代开始，国内开展了大量抗血吸虫病的药物筛选工作。我们前期研究发现青蒿琥酯能够有效杀灭日本血吸虫童虫，具有很好的预防日本血吸虫病的效果。但是，青蒿琥酯抗日本血吸虫的分子机制不甚清楚。microRNAs是在真核生物中发现的一类具有调控功能的内源性非编码RNA，其大小约20-25个核苷酸。研究表明microRNAs广泛参与了血吸虫的生长发育，性别分化和维持以及致病等生物学过程。MicroRNAs作为重要的基因表达调控因子，能够低调药物作用相关功能基因进而影响药物效用。这很大程度上推动了药物基因组学向药物相关microRNAs组学的快速转变与发展。近年来，Solexa高通量测序技术已成为差异microRNAs表达谱鉴定分析的有力工具，尤其在药物相关microRNAs组的研究领域。目前，尚无人开展青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫相关显著性差异microRNAs的高通量鉴定研究。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术缺陷，提供一种高通量筛选、鉴定青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫相关microRNAs的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫microRNA的检测方法，由以下步骤组成；(1)动物分组与尾蚴感染将清洁级小鼠分为青蒿琥酯处理组和对照组，每只小鼠采用腹部贴片法感染尾蚴180～200条/只；(2)药物处理与虫体总RNA抽提青蒿琥酯(Art)溶于质量分数为1％羧甲基纤维素钠溶液，得到Art溶液；尾蚴感染7天后给青蒿琥酯处理组的每只小鼠灌服Art溶液，药物剂量为120mg/kg，对照组仅灌服与Art溶液相同体积的质量分数为1％羧甲基纤维素钠溶液；灌服3天后，每只小鼠均用含有质量分数为0.005％肝素钠的生理盐水溶液经肝门静脉进行灌注冲洗，得到两组10日龄的日本血吸虫，PBS漂洗日本血吸虫3次；将漂洗后的日本血吸虫在-80℃下冷冻保存后，用Trizol试剂分别抽提两组日本血吸虫的总RNA。(3)文库构建与测序采用TruSeqSmallRNASamplePrep试剂盒分别对步骤2提取的两组日本血吸虫的总RNA，构建青蒿琥酯处理组的DNA文库与对照组的DNA文库；针对以上两个DNA文库，用IlluminaHiseq2500平台进行测序，读长为单端50bp；(4)原始数据去冗余将步骤3测序得到的两组测序结果，去除接头序列、mRNA序列、RFam序列、重复序列和非典型microRNA序列，保留18-26bp的核苷酸序列；(5)参考miRBase数据库比对将步骤4得到的两组18-26bp的核苷酸序列分别与miRBase21.0日本血吸虫microRNAs的前体序列进行BLAST比对，筛选出两组18-26bp的核苷酸序列中，与microRNAs的前体序列匹配的microRNAs；(6)青蒿琥酯作用相关microRNA差异表达分析采用Fisherexact和Chi-squared2x2检验方法比较步骤5中筛选出的匹配的microRNAs在两组18-26bp的核苷酸序列中的表达丰度，筛选出差异倍数>2或<0.5的microRNAs，同时计算表达丰度的显著性指数(p-Value)，进一步筛选出pvalue<0.01的microRNAs，即为显著性差异microRNA。进一步地，所述显著性差异microRNA为：如SEQIDNO.1所示的sja-mir-2f-p5，如SEQIDNO.2所示的sja-miR-125b，如SEQIDNO.3所示的sja-miR-3505，如SEQIDNO.4所示的sja-miR-3504，如SEQIDNO.5所示的sja-mir-3486-p3，如SEQIDNO.6所示的sja-miR-3484-5p，以及如SEQIDNO.7所示的sja-miR-2c-3p。本专利技术的有益效果在于：本专利技术将尾蚴感染的小鼠用青蒿琥酯药物干预，利用Solexa高通量深度测序技术，对青蒿琥酯药物处理组和对照组样本进行混池测序分析，首次高通量地研究体内药物处理日本血吸虫后相应microRNAs的差异变化，筛选鉴定出药物作用相关显著性差异microRNAs，为深入研究microRNA在青蒿琥酯抗日本血吸虫中的作用机制奠定基础，为新药的研发提供潜在药物靶点。附图说明图1为18-26bp的短核苷酸序列的表达丰度图。具体实施方式一种青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫相关microRNAs鉴定方法，有以下步骤：1)动物分组与尾蚴感染将100只清洁级ICR小鼠随机分为75只青蒿琥酯药物处理组(ART)和25只对照组(CON)。取阳性钉螺在30-35℃恒温箱孵育7d，清洗后放置于洁净烧杯中，加入去氯离子水，28℃恒湿恒温箱光照下逸出尾蚴。两组小鼠采用腹部贴片法感染尾蚴约200条/只。2)药物处理与虫体收集青蒿琥酯(Art)溶于质量分数为1％羧甲基纤维素钠溶液，得到Art溶液；尾蚴感染7天后给青蒿琥酯处理组的每只小鼠灌服Art溶液，药物剂量为120mg/kg，对照组仅灌服与Art溶液相同体积的质量分数为1％羧甲基纤维素钠溶液；灌服3天后，每只小鼠均用含有质量分数为0.005％肝素钠的生理盐水溶液经肝门静脉进行灌注冲洗，得到两组10日龄的日本血吸虫，PBS漂洗日本血吸虫3次；将漂洗后的日本血吸虫在-80℃下冷冻保存。3)文库构建与测序使用Trizol试剂(Invitrogen,CA,USA)抽提青蒿琥酯处理组与对照组虫体总RNA。根据microRNA的属性，采用试剂盒TruSeqSmallRNASamplePrep(Illumina,SanDiego,USA)分别选取2ug总RNA构建药物处理组文库(ART)和对照组文库(CON)。利用IlluminaHiseq2500平台进行测序，读长为单端50bp。4)原始数据去冗余使用软件ACGT101-miR(LCSciences,Houston,Texas,USA)对测序原始数据进行去冗余。处理组的测序结果中，validreads占72.30％，3ADT和lengthfilter占25.41％，Junkreads占0.20％，重复序列占0.13％，rRNA占1.29％，tRNA占0.36％，snoRNA占0.03％，snRNA占0.06％，以及其他的RfamRNA占0.28％；对照组的测序结果中，validreads占87.04％，3ADT和lengthfilter占10.77％，Junkreads占0.27％，重复序列占0.12％，rRNA占1.14％，tRNA占0.37％，snoRNA占0.03％，snRNA占0.06％，以及其他的RfamRNA占0.27％；通过数据处理清理上述序列，保留18-26bp的短核苷酸序列。18-26bp的短核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫microRNA的检测方法，其特征在于由以下步骤组成；（1）动物分组与尾蚴感染将清洁级小鼠分为青蒿琥酯处理组和对照组，每只小鼠采用腹部贴片法感染尾蚴180~200条/只；（2）药物处理与虫体总RNA抽提青蒿琥酯（Art）溶于质量分数为1％羧甲基纤维素钠水溶液，得到Art溶液；尾蚴感染7天后给青蒿琥酯处理组的每只小鼠灌服Art溶液，药物剂量为120 mg/kg（每kg的小鼠罐服120 mg的Art），对照组仅灌服与Art溶液相同体积的质量分数为1％羧甲基纤维素钠水溶液；灌服3天后，每只小鼠均用含有质量分数为0.005％肝素钠的生理盐水溶液经肝门静脉进行灌注冲洗，得到两组10日龄的日本血吸虫，PBS漂洗日本血吸虫3次；将漂洗后的日本血吸虫在‑80℃下冷冻保存后，用Trizol试剂分别抽提两组日本血吸虫的总RNA；（3）文库构建与测序采用TruSeq Small RNA Sample Prep试剂盒分别对步骤2提取的两组日本血吸虫的总RNA，构建青蒿琥酯处理组的DNA文库与对照组的DNA文库；针对以上两个DNA文库，用Illumina Hiseq2500平台进行测序，读长为单端50 bp；（4）原始数据去冗余将步骤3测序得到的两组测序结果，去除接头序列、mRNA序列、RFam序列、重复序列和非典型microRNA序列，保留18‑26 bp的核苷酸序列；（5）参考miRBase数据库比对将步骤4得到的两组18‑26 bp的核苷酸序列分别与miRBase 21.0日本血吸虫microRNAs的前体序列进行BLAST比对，筛选出两组18‑26 bp的核苷酸序列中，与microRNAs的前体序列匹配的microRNAs； （6）青蒿琥酯作用相关microRNA差异表达分析采用Fisher exact和Chi‑squared 2 x 2 检验方法比较步骤5中筛选出的匹配的microRNAs在两组18‑26 bp的核苷酸序列中的表达丰度，筛选出差异倍数 > 2 或 < 0.5的microRNAs，同时计算表达丰度的显著性指数（p‑Value），进一步筛选出pvalue < 0.01的microRNAs，即为显著性差异microRNA。...

【技术特征摘要】
1.一种青蒿琥酯作用日本血吸虫童虫microRNA的检测方法，其特征在于由以下步骤组成；（1）动物分组与尾蚴感染将清洁级小鼠分为青蒿琥酯处理组和对照组，每只小鼠采用腹部贴片法感染尾蚴180~200条/只；（2）药物处理与虫体总RNA抽提青蒿琥酯溶于质量分数为1％羧甲基纤维素钠水溶液，得到Art溶液；尾蚴感染7天后给青蒿琥酯处理组的每只小鼠灌服Art溶液，药物剂量为120mg/kg，对照组仅灌服与Art溶液相同体积的质量分数为1％羧甲基纤维素钠水溶液；灌服3天后，每只小鼠均用含有质量分数为0.005％肝素钠的生理盐水溶液经肝门静脉进行灌注冲洗，得到两组10日龄的日本血吸虫，PBS漂洗日本血吸虫3次；将漂洗后的日本血吸虫在-80℃下冷冻保存后，用Trizol试剂分别抽提两组日本血吸虫的总RNA；（3）文库构建与测序采用TruSeqSmallRNASamplePrep试剂盒分别对步骤2提取的两组日本血吸虫的总RNA，构建青蒿琥酯处理组的DNA文库与对照组的DNA文库；针对以上两个DNA文库，用IlluminaHiseq2500平台进行测序，读长为单端50bp；（4）原始数据去冗余将步骤3测序得到的两组测序结果，去除接头序列、mRNA序列、RFam序列、重复序列和非典型microRNA序列，保留18-26bp的...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔庆明，陈睿，童群波，楼涤，丁建祖，郑斌，陈晓恒，陆绍红，
申请(专利权)人：浙江省医学科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33