日本血吸虫重组抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原是由含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区基因的重组载体经表达而制得。本发明专利技术还公开了该日本血吸虫重组抗原的制备方法及其在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。本发明专利技术的日本血吸虫重组抗原，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组抗原的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体并能达到一个较高水平，动物保护实验诱导了32.4％的减虫率和41.41％的减卵率，表明该重组抗原适于作为抗血吸虫病候选疫苗，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种日本血吸虫重组抗原及其制备方法 和应用。
技术介绍
日本血吸虫病是一种在我国南方流行的严重危害人、畜健康、影响社会和经济发 展的人畜共患寄生虫病，是我国最重要的公共卫生问题之一。上世纪五十年代以来，我国血 吸虫病防治取得了巨大成绩，但由于部分传统疫区（洞庭湖区、鄱阳湖区和部分江湖洲滩 地区）血吸虫病流行的生态环境难以有效改变，要阻断血吸虫病传播仍是一项长期、艰巨、 复杂的任务。目前针对终末宿主（人、牛、羊等）的主要防治手段是进行药物治疗，吡喹酮 是目前唯一一种大规模应用的血吸虫病治疗药物，但不能解决重复感染难题。防治实践表 明，由于血吸虫中间宿主钉螺难予消灭，家畜传染源未能得到有效控制，以药物治疗为主的 防治策略难予阻断血吸虫病传播，迫切需要开拓防治新途径。加强血吸虫病疫苗的研制与 开发，将疫苗的长效预防作用和治疗药物的短效作用相结合，是血吸虫病防治研究的重要 发展战略，也是当前我国血防工作的重大需求。 血吸虫尾蚴钻入终末宿主皮肤转变为童虫，移行经过肺脏、肝脏后发育为成虫，并 在宿主体内繁殖产卵、长期寄生。血吸虫寄居的血液环境为其提供了适宜的生理生化环境 及营养、激素、信号分子等物质，但也使它直接暴露于宿主的免疫效应因子中，如宿主补体。 补体系统是机体免疫防御机制的重要组成部分，其作用的发挥依赖补体系统的激活。补体 级联反应的激活包括3条途径，分别为经典途径、替代途径和凝集素途径。经典途径在特异 性免疫的效应阶段发挥作用；替代途径和旁路途径参与非特异性免疫，在感染早期抵抗病 原微生物感染中发挥重要作用。 血吸虫尾蚴突破皮肤屏障后就受到宿主免疫应答的攻击，补体反应是宿主最早开 始杀伤虫体的免疫应答，在宿主对血吸虫的免疫杀伤中具有重要作用，是宿主获得性非特 异性抗力的机理之一。但是血吸虫在长期的进化过程中也积累了应对宿主补体系统的适 应性，对补体系统的抑制和调节是其免疫逃避策略的重要组成部分。血吸虫在尾蚴阶段对 血清补体是非常敏感的，但在尾蚴转变为童虫2-4小时后对血清补体杀伤的敏感性就开始 逐渐下降，这表明血吸虫在感染早期就对宿主的补体反应有抑制或调节作用，这种转变可 能和血吸虫膜结构变化和体被表膜上的分子有关。现已发现多个血吸虫分子可能和补体 免疫调节相关，并且作用于补体反应的多个节点。相关分子在血吸虫调节宿主补体免疫反 应中的作用已有一些报道，研究主要是在曼氏血吸虫中进行的，如TOR、Paramyosin(又名 SCIP-1)、DAF(CD55)、m28、Smpi56 等分子。其中TOR(trispanningorphanreceptor,四跨膜孤儿受体），又称 CRIT(complementC2receptorinhibitortrispanning)，是一种调节补体C2 分子的蛋 白。首先在埃及血吸虫、曼氏血吸虫中鉴定得到，因此沿用原名T0R，后发现广泛分布在包 括从早期的硬骨鳕鱼到大鼠和人类多种生物，改称CRIT。对CRIT分子的特性和功能研究 表明，CRIT分子可在人体造血细胞和许多组织中表达，CRIT分子和C4b分子具有相同的补 体C2结合位点。溶血试验说明，CRIT可与C2补体结合阻止C3转化酶形成，从而阻断补体 级联反应。HuiKM等研究发现CRIT也可通过其edl的一段多肽CRIT-H17阻断D因子介 导的B因子的裂解从而干扰补体替代途径的激活。研究发现，克氏锥虫Y株和Colombiana 株对补体的敏感性差异与其CRIT分子的表达动态相关，CRIT基因过表达的虫体阶段 (stationary-phaseepimastigotes短膜型静止期虫体）能抵抗血清补体的裂解作用，而 且锥虫CRIT分子能抑制补体经典和凝集素途径的激活效应。后续研究表明，CRIT还可以 通过抑制MASP2对C2的裂解，阻止C3转化酶形成，从而抑制凝集素途径激活补体作用。关 于血吸虫TOR分子的研究报道见于埃及血吸虫和曼氏血吸虫。1999年JameelM.Inal等首 先鉴定了埃及血吸虫ShTOR和曼氏血吸虫SmTOR蛋白分子，研究表明ShTOR是一种新型的 三跨膜结构域受体，分布在血吸虫体被表面，在血吸虫童虫期高表达，重组ShTOR可被狒狒 辐射尾蚴免疫血清所识别，表明TOR分子是一个有潜力的血吸虫疫苗候选抗原分子。 但是到目前为止，还没有出现关于日本血吸虫SjTOR重组蛋白作为血吸虫疫苗应 用的研究报道。
技术实现思路
本专利技术要解决目前缺乏抗血吸虫高效疫苗的技术问题，提供一种日本血吸虫重组 抗原，该重组抗原包含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区（SjTOR-edl)的SEQ IDNO. 1所示氨基酸序列，具有良好的免疫原性，适于作为抗血吸虫病候选疫苗。 此外，还需要提供一种上述日本血吸虫重组抗原的制备方法和应用。 为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现： 在本专利技术的一个方面，提供了一种重组载体，包含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N 端第一个膜外区（SjTOR-edl)基因，该基因序列是编码SEQIDNO. 1所示氨基酸序列的核 苷酸序列。 优选的，所述基因序列是SEQIDN0. 2所示核苷酸序列。 更优选的，所述重组载体的空载体为原核表达载体pET28a(+)，所述日本血吸虫四 跨膜孤儿受体N端第一个膜外区（SjTOR-edl)基因插入在空载体pET28a(+)的EcoRI和 XhoI两个酶切位点之间。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原是由上述 重组载体经表达而制得。 本专利技术的日本血吸虫重组抗原，还包含由部分载体序列表达的具有几个组氨酸的 标签序列，该标签序列仅是便于后续的重组抗原蛋白的纯化。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。 在本专利技术的另一方面，还提供了 一种上述日本血吸虫重组抗原的制备方法，包括 以下步骤： 构建含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区（SjTOR-edl)基因的重组表 达载体； 将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞； 培养包含所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组 表达载体表达日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区（SjTOR-edl)。 优选的，还包括步骤：将诱导表达获得的日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个 膜外区蛋白进一步纯化。 在本专利技术的一个具体实施例中，构建含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜 外区（SjTOR-edl)基因的重组表达载体，具体包括以下步骤：利用生物信息学进行在线分 析，找出编码日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区（SjTOR-edl)的核苷酸片段； 根据该核酸序列设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点，PCR扩增核酸片 断，再利用特异限制性内切酶EcoRI、Xh〇I将编码SjTOR-edl抗原的核酸片段定向克隆至 原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pET28a(+) -SjTOR-edl。 在本专利技术的另一方面，还提供了 一种包含上述日本血吸虫重组抗原的抗血吸虫疫 苗。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种能与上述日本血吸虫重组抗原特异性结合的 抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组载体，其特征在于，包含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区基因，该基因序列是编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：傅志强，马帅，洪炀，林矫矫，伍妙梨，陆珂，李浩，朱传刚，韩艳辉，贾秉光，曹晓丹，韩倩，宰金丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31