牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法技术

本发明专利技术公开了一种牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法，属于动物寄生虫病诊断技术领域。试纸条由样品垫、免疫探针干片、层析膜、吸水纸、PVC基板及箭头标签胶膜与手柄标签胶膜组合而成。免疫探针干片是以聚苯乙烯乳胶微球的羧基与兔抗牛IgG抗体蛋白的胺基形成共价键结合物后吸附于聚脂膜后制成；层析膜是以锚固在硝酸纤维素膜上的血吸虫可溶性抗原为检测线、羊抗兔IgG抗体为质控线制成；可快速检测牛血清中的血吸虫抗体，操作简便，结果直观、准确。可广泛用于牛血吸虫病的诊断、普查和检疫。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及家畜寄生虫病的诊断
，具体涉及。
技术介绍
血吸虫病是人畜共患的寄生虫病。当前我国尚有7省( 自治区)100多个县未达到血吸虫病的传播控制标准。牛是血吸虫病的重要传染源。由于受长江季节性洪水等自然因素及人畜流动频繁等社会因素的影响，近年来我国血吸虫病疫情又出现了反复，患病的人畜增加。我国一直来均将血吸虫病列为动物疫病监测及检疫的重要对象。因此，对调运家畜的血吸虫病的过境检疫、对现疫区家畜的血吸虫病普查及对历史上曾经发生过血吸虫病流行区的牲畜的监测是一项长期而艰巨的任务。因此，研究家畜血吸虫病快速检测的方法对防制和消灭血吸虫病具有重要意义。目前诊断家畜血吸虫病的方法主要有粪孵血吸虫毛蝴法、ELISA法、IHA法和金标免疫渗滤法。粪孵毛蝴法只有在动物感染血吸虫后5周以上才能粪孵出血吸虫毛蝴，并且粪便中的虫卵数量有波动，轻度感染的病畜尤易漏检，且用粪孵法检测一个样品需耗时5 6个小时，随着劳动力工资大幅上涨，该法在家畜血吸虫病的普查中已很少被采用。ELISA方法操作繁琐、时间长、酶试剂难以保存、影响因素多，检测需专用仪器设备、试验中使用的某些材料易造成环境污染，对人健康有害。IHA稳定性较差，敏感性不如ELISA法，实验所需时间也较长。ELISA法和IHA法都不能满足现场检疫的要求。金标免疫渗滤法具有检测速度快、操作简便不需特殊仪器等特点，适合于血吸虫病的现场检疫、诊断和普查。但其诊断试剂为液体，稳定性较差，保存要求高(需4°C冰箱保存)，保存期短(仅6个月)，试剂及反应板体积大，邮寄和航空运输受限，增加了保存、运输费用及运输所需的时间。金标免疫层析法可以克服金标免疫渗滤法的这些缺点。国内有数家单位对人血吸虫病金标免疫层析法进行过研究，但由于各种原因都没有批量生产和实践中推广开来。从理论上分析，胶体金与抗原或抗体的结合均是通过正负电荷的静电引力结合在一起的。这种结合的牢固程度容易受溶液PH值和其他离子强度的影响，因此其最适pH范围往往很小，检测的可重复性较差。胶体金与抗原或抗体的结合还可能被血液中或试剂中加入的称作为稳定剂的其它蛋白与胶体金之间竞争性结合的影响，使试剂较快失效或者出现假阳性。可以说这是金标方法本身具有的局限性。从理论上说，通过共价键使分子之间结合的牢固程度要强于由静电引力结合的强度。乳球免疫层析技术正是继免疫胶体金技术后新近发展起来的一种以共价键结合为特点的免疫标记新技术。本专利技术的检测试剂为乳胶微球标记的兔抗黄水牛IgG抗体，乳胶微球与兔抗黄水牛IgG抗体之间以共价键结合，所以该复合物稳定性好，且乳胶微球的直径比胶体金大10 20倍，信号强度大，可提高试剂的灵敏度和阳性样本的检出率。
技术实现思路
本专利技术目的是，针对牛日本血吸虫病ELISA和IHA诊断法存在操作步骤多、速度慢、不能满足现场检疫需求，和金标免疫渗滤法检测试剂系液体，保存期较短，不能空运或邮寄等缺陷，为牛日本血吸虫病的诊断、检疫和普查提供一种敏感、特异、安全、稳定性好、信号强度大，且为固体状态、没有污染的检测试纸条，及在5 15分钟内即可完成的快速，简便的检测方法。本专利技术的原理是采用有机化学方法使红色或其它颜色的聚苯乙烯乳胶微球羧基化后，使兔抗黄水牛IgG抗体蛋白的胺基与乳胶微球的羧基形成共价键，使该染色乳胶微球标记的兔抗黄水牛IgG抗体的结合物作为检测试剂(免疫探针)；再将该液状的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物以喷雾法使之吸附在聚脂膜上，经烘干成固体状的免疫探针干片；另以硝酸纤维素膜作为层析膜，并用划膜喷金仪在该膜的不同位置上画出血吸虫卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗体两条直线，分别作为检测线(T线)和质控线(C线);然后按照样品垫、免疫探针干片、层析膜和吸水滤纸的顺序，以头尾部分重叠的形式装配在PVC基板上，再贴上箭头标签胶膜与手柄标签胶膜后，用切条机按设定宽度裁切后即成牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。 检测时，将待检稀释血清滴在试纸条的样品垫上(或将裸露的样品垫插入待检稀释血清中10s)，血清液通过毛细管作用流经免疫探针干片，将吸附在聚酯膜上的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物溶解成游离状，如果血样中存在有牛抗血吸虫抗体(即阳性牛血样)，则该血样中的抗体将会与部分游离状的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物相结合，形成牛抗血吸虫抗体-兔抗黄水牛IgG抗体-乳胶微球的三联红色或其它颜色的复合物后，并沿着硝酸纤维素膜继续向前移行，当这种红色或其它颜色的复合物移行到预先锚固着血吸虫抗原的检测线(T线)上时，该血吸虫抗原将会与复合物中的牛抗血吸虫抗体相结合，而形成更大的四联复合物而使T线呈显红色或其它颜色的条带；而剩余的未与牛抗血吸虫抗体相结合的游离状乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物将继续往前移行，当与锚固在硝酸纤维素膜上的羊抗兔IgG抗体质控线(C线)相遇时，便形成羊抗兔IgG抗体-兔抗黄水牛IgG抗体-乳胶微球的三联红色复合物,使C线呈现红色条带；如果血样中不存在牛抗血吸虫抗体(即阴性牛血样)，则就不能形成牛抗血吸虫抗体-兔抗黄水牛IgG抗体-乳胶微球的三联复合物，而单纯的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物是不能与T线上的血吸虫抗原相结合的，所以检测线(T线)不能呈现红色或其它颜色的条带，而只有质控线(C线)仍呈显红色或其它颜色的条带；如果检测线与质控线均没有出现红色条带，则说明该试纸条已失效或者检测操作有误。本专利技术目的通过以下技术方案予以实现I、一种检测牛日本血吸虫病抗体的试纸条，该试纸条由部件样品垫、免疫探针干片、层析膜、吸水纸、PVC基板及箭头标签胶膜与手柄标签胶膜组合而成；其中，免疫探针干片是以红色或其它颜色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的羧基，与兔抗黄水牛IgG抗体蛋白的胺基形成共价键结合物后作为免疫探针的检测试剂液吸附于聚脂膜后制成；层析膜是以硝酸纤维素膜为膜基，用划膜喷金机将血吸虫卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗体分别在该膜上画出检测T线和质控C线而成；先将上述前四部件按头尾部分重叠粘合装配在PVC基板上，再将箭头标签胶膜粘贴在免疫探针干片上，另将手柄标签胶膜粘贴在吸水纸上后，用切条机按设定宽度裁切后即成牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。2、一种制备牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的方法，该方法按以下步骤进行(I)免疫探针干片的制备包括I)兔抗黄水牛IgG的制备①黄水牛IgG的制备采集健康黄牛、水牛血液,分别分离血清后取血清各5ml混合，加等量O. 85%NaCl，用30%硫酸铵沉淀法提取黄水牛IgG，沉淀的黄水牛IgG用原血清体积2倍量的O. 85%NaCl溶解，再用35%硫酸铵沉淀法重复提取2次，最后用5ml O. 85%NaCl溶解离心沉淀的黄水牛IgG，用透析法除去溶液中的NH4+及SO/—后，再用蒸馏水稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，调节蛋白浓度至10mg/ml后，于_20°C密封贮存备用；②黄水牛IgG免疫兔将黄水牛IgG与弗氏完全佐剂按体积3:7比例制成油乳剂，按黄水牛IgG 6mg/只兔用量，对体重2. 5kg的健康雄性家兔，在兔颈部皮下和兔双侧后足 踱垫皮下注射进行首次免疫；后除用弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂外，再按上述同样配比、方法，每隔两周进行一次加强免疫，共进行三次本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测牛日本血吸虫病抗体的试纸条，其特征在于该试纸条由部件样品垫、免疫探针干片、层析膜、吸水纸、PVC基板及箭头标签胶膜与手柄标签胶膜组合而成；其中，免疫探针干片是以红色或其它颜色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的羧基，与兔抗黄水牛IgG抗体蛋白的胺基形成共价键结合物后作为免疫探针的检测试剂液吸附于聚脂膜后制成；层析膜是以硝酸纤维素膜为膜基，用划膜喷金机将血吸虫卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗体分别在该膜上画出检测T线和质控C线而成；先将上述前四部件按头尾部分重叠粘合装配在PVC基板上，再将箭头标签胶膜粘贴在免疫探针干片上，另将手柄标签胶膜粘贴在吸水纸上后，用切条机按设定宽度裁切后即成牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢福庄，张雪娟，顾昀，付媛，季敬余，冯尚连，俞国乔，杨玉焕，周煜，阳爱国，董国栋，郭莉，毛光琼，石团员，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：