日本血吸虫1ZD11基因的克隆制造技术

本发明专利技术提供了日本血吸虫（中国大陆株）１ＺＤ１１基因的基因序列筛选方法和克隆。本发明专利技术应用抑制性杂交技术，以日本血吸虫尾蚴为实验组，成虫为驱动组，构建了尾蚴消减质粒文库，由该文库挑选克隆定制ｃＤＮＡ微陈列，经杂交分析，获得一批在尾蚴和成虫间差异表达的ｃＤＮＡ克隆。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的核苷酸序列、日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的克隆。
技术介绍
血吸虫病是由血吸虫感染引起的分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。是亟待解决的严重的公共卫生问题。目前血吸虫病的主要防治策略是在易感地区大规模化疗、灭螺及健康教育，但由于治疗药物不能解决血吸虫病重复感染的难题，使得人、畜的重复感染问题突出，特别是本病的主要传染源家畜的重复感染，难以实现对该病的长期有效控制。因此，人用特别是家畜用的抗血吸虫病疫苗的研究与应用成为血吸虫病防治的重要发展战略。血吸虫在生长发育方面的表现非常特殊、复杂，在整个生活史循环过程中，呈现显著的生物学和形态学变化。这种不同发育阶段的形态学上和生物学上的变化必然伴随着不同的基因差异表达模式，导致血吸虫独特的代谢和发育过程，同时也使血吸虫的抗原性十分复杂，血吸虫疫苗的研制也因此成为一个世界性难题。为从分子水平探索血吸虫生长、发育、生殖及与宿主的相互作用等生命活动的机理，增加对病原体重要的功能分子的了解，以使血吸虫疫苗的开发能有所突破，开展了日本血吸虫发育期别差异表达基因的筛选研究工作。首先应用抑制性消减杂交和cDNA微阵列分析获得了不同发育阶段的差异表达基因的基础材料，选择一批克隆测序获得了相应基因的ESTs(表达序列标签)，经同源性分析证实与数据库中已有的数据无明显同源性的，可视为血吸虫新基因。新基因的获取、鉴定以及所编码蛋白的功能研究，有助于发现与血吸虫的生长发育、致病性等密切相关的功能分子，可为血吸虫高效疫苗、诊断制剂以及新药的开发开拓新途径。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于应用抑制性消减杂交技术，以日本血吸虫尾蚴为实验组，日本血吸虫成虫为驱动组构建了尾蚴消减质粒文库，经cDNA微阵列分析获得了日本血吸虫尾蚴阶段高表达的1ZD11基因，并对其进行了克隆和核苷酸序列分析。本专利技术提供了日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的基因序列，它具有序列1的核苷酸序列及相应的氨基酸序列。本专利技术的另一目的是提供了日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的核苷酸序列的筛选方法，该方法是以日本血吸虫尾蚴为实验组，成虫为驱动组，构建日本血吸虫尾蚴消减质粒文库，由消减文库随机挑克隆定制cDNA微阵列，经cDNA微阵列杂交分析后再挑选克隆测序，获得了1ZD11基因的表达序列标签。本专利技术应用抑制性消减杂交技术，以日本血吸虫尾蚴为实验组，成虫为驱动组，构建了尾蚴消减质粒文库，由该文库挑选克隆定制cDNA微阵列，经杂交分析，获得一批在尾蚴和成虫间差异表达的cDNA克隆。选择部分克隆进行了ESTs测序，然后利用NCBI的BLAST进行基因序列的同源性分析，结果发现一个基因克隆与数据库中已有的数据无显著同源性(Score值＜50bits)，表明该基因为一血吸虫新基因，命名为1ZD11。以该基因的ESTs序列为模板，应用RACE技术对这一基因的cDNA片段分别进行了3′和5′延伸。DNA序列分析表明该基因(1ZD11)的开放阅读框含261bp的序列，推测编码86个氨基酸的蛋白质。经DNAMAN软件分析，1ZD11 DNA序列分析表明该基因(1ZD11)的开放阅读框含261bp的序列，推测编码86个氨基酸的蛋白质，理论分子量为9.9249ku，等电点为7.77，为中性蛋白。有5个抗原位点，具有信号肽，推测信号肽裂解位点在24-25位氨基酸之间，具有1个典型疏水性区域，无跨膜结构。具有1个蛋白激酶C磷酸化位点，在23-82位间氨基酸与多花文昌鱼的Wnt7b蛋白具有34％的同源性，与人的Wnt7a蛋白具有33％的同源性。本专利技术的又一目的是提供了日本血吸虫(中国大陆株)1ZD11基因的核苷酸序列的筛选方法，该方法获得了序列3的日本血吸虫1ZD11基因完整核苷酸序列。其编码的蛋白具有序列2的氨基酸序列。附图说明图1重组质粒pCR2.1-TOPO/1ZD11的EcoR I酶切鉴定电泳图谱MDNA Marker 2,000；1重组质粒的酶切产物图2重组质粒pCR2.1-TOPO/1ZD11的PCR鉴定电泳图谱MDNA Marker 2,000；1重组质粒的PCR产物具体实施方式实施例1一、日本血吸虫尾蚴消减文库的构建及cDNA微阵列分析1.材料1.1.实验动物新西兰大白兔购自中科院上海分院实验动物中心，体重2.5kg，用作日本血吸虫中国大陆株的感染宿主。1.2.日本血吸虫中国大陆株安徽品系尾蚴中国农科院上海家畜寄生虫病研究所钉螺室提供。1.3.质粒、菌种pCR2.1-TOPO克隆载体购自Invitrogen公司、DH5α感受态细胞购自博大泰克公司。1.4.主要试剂及工具酶总RNA提取试剂TRIzol、GeneRacerTMKit购自Invitrogen公司，mRNA分离试剂盒oligotex mRNA midikit为Qiagen产品。PCR-selectTMcDNA subtraction kit，Advantage cDNAPolymerase，NucleoSpinExtraction Kit为Clontech公司产品。小量质粒抽提试剂盒购自上海赛百盛基因技术有限公司。Percoll、氨苄青霉素购自华美生物工程公司。Trypsin、Collagenase II购自上海生工生物工程有限公司。限制性内切酶EcoRI、Xho I、T4DNA连接酶、ExTaq DNA高保真DNA聚合酶、DL2000marker购自宝生物工程(大连)有限公司。Cy3-dCTP和Cry5-dCTP以及random primer labeling system购自Amersham Phamacia生物技术有限公。芯片杂交试剂盒为博星基因芯片有限公司产品。cDNA微阵列的制作、探针标记、芯片杂交、芯片扫描以及数据采集委托上海博星基因芯片有限公司完成。1.5.引物3′RACE特异引物1ZD1NP 5′ACGCTTCTCTTACACTATCCTTCCA 3′(404-428)1ZD1P 5′TTGTAACGCTTCTCTTACACTATCC 3′(399-423)5′RACE特异引物1ZD 1RP5′CACGCCATTTGAGATATCATGAATG 3′(71-95)1ZD 1NRP 5′ATCAATGATGCGATGAGGACTTTGC 3′ (41-65)RT-PCR引物Upper 5′TTGGATCCATGTTAAGTACAGCCTGC 3′(25-42)Down 5′CTCTCGAGTCACTGGCACAATTCTTTC 3′ (258-276)1ZD11P、1ZD11NP为1ZD11基因3′RACE的第一轮和第二轮PCR引物；1ZD11RP、1ZD11RNP为1ZD11基因5′RACE的第一轮和第二轮PCR引物；upper和down为扩增1ZD11基因编码区的上下游引物。括号内的数字表示该引物在此基因片段中的位置。引物由英俊生物技术有限公司合成。2.方法2.1.日本血吸虫尾蚴和成虫的收集尾蚴的收集感染的阳性钉螺置于加满去氯水的15ml试管中，于25℃室温条件下光照过夜，次日早晨尾蚴逸出浮于水面。将含有尾蚴的水转入35mlDEP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码日本血吸虫中国大陆株１ＺＤ１１基因的核苷酸序列，其特征在于它具有序列１的核苷酸序列及相应的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苑纯秀，林矫矫，陆珂，冯新港，傅志强，刘金明，蔡幼民，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所，农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海动物生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]