环介导等温扩增检测旋毛虫基因的引物组、应用和方法技术

本发明专利技术公开了一种环介导等温扩增检测旋毛虫基因的引物组、应用和方法。所述引物组包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一对环引物LF/LB，引物组用于检测旋毛虫虫体及虫卵；方法包括提取待测样品基因组DNA；以基因组DNA为模板，加入至等温扩增反应液中，水浴反应获得反应产物；等温扩增反应液包括LAMP缓冲液、引物组、Bst 2.0 DNA聚合酶、焦磷酸酶、dNTP、MgSO4和ddH2O，将反应产物与检测液混合，若溶液变为蓝色则结果为阳性，若溶液保持无色则结果为阴性。本发明专利技术可快速、准确检测旋毛虫基因组DNA，敏感性高、特异性强，有较好的稳定性，操作简单，能较好地满足不同层次人员的需求，易于向基层推广。

Primer set, application and method of loop mediated isothermal amplification for detection of Trichinella spiralis gene

【技术实现步骤摘要】
环介导等温扩增检测旋毛虫基因的引物组、应用和方法
本专利技术属于寄生虫检测
，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术结合焦磷酸示踪技术快速检测旋毛虫的引物及其应用。
技术介绍
旋毛虫是一种重要的人畜共患寄生虫病，感染会引起人和其他多种动物(如猪、犬、猫、熊、狐、鼠)的严重疾病——旋毛虫病，不仅给畜牧养殖业造成巨大的经济损失，也对人类的身体健康带来巨大的威胁。采用快速、敏感而准确的诊断检测方法在旋毛虫病的防治上具有重要的意义。对于动物旋毛虫病的检测通常采用镜检或集样消化法，但两种方法都存在费时费力的不足，镜检法更是容易出现漏检误检的状况，给现场和基层单位的检测带来诸多不便。运用PCR、Real-timePCR等方法能提高旋毛虫的检测敏感性，但是存在需要专门的仪器设备及专业的技术操作人员等限制，也不利于在基层和现场的推广使用。
技术实现思路
基于缺少快速、准确检测旋毛虫感染的临床检测方法的实际，为满足疾病防控的需求，本专利技术提供了一种等温扩增检测旋毛虫基因引物及其检测应用程序，检测方法特异性强、灵敏度高。本专利技术根据旋毛虫1.6kb重复序列基因序列X06625.1进行了引物设计，提供了旋毛虫等温扩增反应所需的引物组共6条，包括外引物F3、B3，内引物FIP、BIP及环引物LB、LF。本专利技术还提供了包括引物在内的等温扩增反应液，除引物外，还含有LAMP缓冲液。本专利技术还提供了检测液。本专利技术所采用的的技术方案如下：一、一种环介导等温扩增检测旋毛虫基因的引物组：所述引物组包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一对环引物LF/LB，其核苷酸序列如下所示：外引物F3：5’-gccatgtctgtaacaccag-3’，如SEQIDNo.1；外引物B3：5’-agtattacattccatagagagga-3’，如SEQIDNo.2；内引物FIP：5’-caaaccgctcatattcgttagggtaaatactcgtgaagctttgct-3’，如SEQIDNo.3；内引物BIP：5’-aagggttcttcttaccaattttccgaccattaccaaacatgtgtg-3’，如SEQIDNo.4；环引物LF：5’-cgctgtgaaatgcaatg-3’，如SEQIDNo.5；环引物LB：5’-ttgtacctgtgtttctccg-3’，如SEQIDNo.6。所述的引物组中，外引物F3和B3终浓度为5pmol，内引物FIP和BIP终浓度为40pmol，环引物LF和LB终浓度为20pmol。所述引物组在检测旋毛虫虫体及虫卵中的应用，能利用环介导等温扩增检测旋毛虫基因组。二、一种采用权利要求1所述引物组的检测旋毛虫虫体及虫卵的方法：(1)提取待测样品基因组DNA；(2)配置环介导等温扩增反应：以步骤(1)所提取的2uL基因组DNA为模板，加入至等温扩增反应液中，64℃水浴下反应40分钟获得反应产物；等温扩增反应液包括LAMP缓冲液、引物组、Bst2.0DNA聚合酶、焦磷酸酶、dNTP、MgSO4和ddH2O，引物组为权利要求1中所述的引物组；(3)反应结果的判定：将反应产物与检测液混合，若溶液变为蓝色则结果为阳性，若溶液保持无色则结果为阴性。所述的LAMP缓冲液包括终浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、质量分数0.1％的Tween-20和1M的甜菜碱。所述的BstDNA聚合酶、焦磷酸酶、dNTP和MgSO4在等温扩增反应液中的终浓度为8U、8U、1.5mM和7.5mM。所述的检测液为由4uL钼酸-酒石酸钾氧锑溶液、106uL蒸馏水、2uL的质量分数为10％的抗坏血酸和106uL双蒸水构成的混合溶液，钼酸-酒石酸钾氧锑溶液包含有21mM钼酸、2mM酒石酸钾氧锑和5M硫酸。与常规检测方法相比，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术所设计的引物组，可特异性扩增旋毛虫基因组DNA，最低可检测到的模板DNA，与常规方法相比大大提高了检测灵敏度；2.本专利技术使用的检测液，通过颜色变化判定检测结果，实现检测结果的可视化。综合来说，本专利技术能快速、准确地检测旋毛虫的基因组DNA，敏感性高、特异性强，有较好的稳定性，操作简单，能较好地满足不同层次人员的需求，易于向基层推广。附图说明图1引物的特异性检测结果。1-7分别为旋毛虫、广州管圆线虫、异尖线虫、颚口线虫、蛲虫、血吸虫和伊式锥虫基因组DNA，N为蒸馏水。图2引物的灵敏性检测结果。1-6分别为17pg,1.7pg,170fg,17fg,1.7fg和0.17fg旋毛虫基因组DNA，N为蒸馏水。图3焦磷酸酶检测灵敏度的检测结果。1-51.7pg,170fg,17fg,1.7fg和0.17fg旋毛虫基因组DNA，N为蒸馏水。具体实施方式本技术结合附图和具体实施例作进一步说明，应该理解，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术范围。本专利技术的实施例如下：实施例2引物的特异性检测以旋毛虫、广州管圆线虫、异尖线虫、颚口线虫、蛲虫、血吸虫和伊式锥虫基因组DNA为模板，将各模板加入反应管中，并加入引物组F3，B3，FIP，BIP，LB和LF，8UBst2.0DNA聚合酶，1.5mMdNTP，7.5mMMgSO4和ddH2O，此外还要加入1μl浓度为25μM的SYTO13荧光染料，在伯乐的荧光定量PCR仪上进行反应，具体的反应程序为：65℃反应1.5h并收集荧光数据，95℃反应5min。结果如图1所示，该引物组能检测到旋毛虫基因组DNA，不能检测出广州管圆线虫、异尖线虫、颚口线虫、蛲虫、血吸虫和伊式锥虫基因组DNA，表明该引物具有良好的特异性。实施例3引物的灵敏性检测将旋毛虫基因组DNA倍比稀释成17pg,1.7pg,170fg,17fg,1.7fg和0.17fg并分别加入反应管中，管中还加入了引物F3，B3，FIP，BIP，LB和LF，8UBst2.0DNA聚合酶，1.5mMdNTP，7.5mMMgSO4和ddH2O，此外还要加入1μl浓度为25μM的SYTO13荧光染料，在伯乐的荧光定量PCR仪上进行反应，具体的反应程序为：65℃反应1.5h并收集荧光数据，95℃反应5min。结果如图2所示，该引物和反应体系最低能检测到1.7fg的旋毛虫基因组DNA，具有良好的检测灵敏度。实施例4焦磷酸酶检测灵敏度的检测将旋毛虫基因组DNA倍比稀释成17pg,1.7pg,170fg,17fg,1.7fgand0.17fg并分别加入反应管1中，管中还加入了引物F3，B3，FIP，BIP，LB和LF，8UBst2.0DNA聚合酶，1.5mMdNTP，7.5mMMgSO4和ddH2O，此外还要加入8U焦磷酸酶，在在63℃水浴中反应40分钟，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环介导等温扩增检测旋毛虫基因的引物组，其特征在于：/n所述引物组包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一对环引物LF/LB，其核苷酸序列如下所示：/n外引物F3：5’-gccatgtctgtaacaccag-3’，如SEQ ID No.1；/n外引物B3：5’-agtattacattccatagagagga-3’，如SEQ ID No.2；/n内引物FIP：5’-caaaccgctcatattcgttagggtaaatactcgtgaagctttgct-3’，如SEQ IDNo.3；/n内引物BIP：5’-aagggttcttcttaccaattttccgaccattaccaaacatgtgtg-3’，如SEQ IDNo.4；/n环引物LF：5’-cgctgtgaaatgcaatg-3’，如SEQ ID No.5；/n环引物LB：5’-ttgtacctgtgtttctccg-3’，如SEQ ID No.6。/n

【技术特征摘要】
1.一种环介导等温扩增检测旋毛虫基因的引物组，其特征在于：
所述引物组包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一对环引物LF/LB，其核苷酸序列如下所示：
外引物F3：5’-gccatgtctgtaacaccag-3’，如SEQIDNo.1；
外引物B3：5’-agtattacattccatagagagga-3’，如SEQIDNo.2；
内引物FIP：5’-caaaccgctcatattcgttagggtaaatactcgtgaagctttgct-3’，如SEQIDNo.3；
内引物BIP：5’-aagggttcttcttaccaattttccgaccattaccaaacatgtgtg-3’，如SEQIDNo.4；
环引物LF：5’-cgctgtgaaatgcaatg-3’，如SEQIDNo.5；
环引物LB：5’-ttgtacctgtgtttctccg-3’，如SEQIDNo.6。


2.根据权利要求1所述的一种环介导等温扩增检测旋毛虫基因的引物组，其特征在于：所述的引物组中，外引物F3和B3终浓度为5pmol，内引物FIP和BIP终浓度为40pmol，环引物LF和LB终浓度为20pmol。


3.根据权利要求1所述引物组的应用，其特征在于：在检测旋毛虫虫体及虫卵中的应用。


4.一种采用权利要求1所述引物组...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔庆明，卓洵辉，童群波，陆绍红，丁豪杰，郑斌，楼涤，丁建祖，陈睿，
申请(专利权)人：浙江省医学科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33