猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金快速检测试纸条及方法技术

本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金快速检测试纸条及方法。包括PVC板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、C线和T线，胶体金试纸条中采用金标蛋白CAP重组蛋白，为去核定位信号的优势抗原表位肽并带有His标签，通过原核表达系统低温诱导表达至上清液；标记于T线(抗原检测试纸条)或C线(抗体检测试纸条)的抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清，通过CNBr活化琼脂糖凝胶FF偶连CAP重组蛋白后纯化处理。本发明专利技术能快速检测猪血清中的抗原或抗体，敏感性高、特异性强，有较好的稳定性，操作简单，能较好地满足不同层次的需求，易于向基层推广。

Test strip and method for rapid detection of porcine circovirus type 2 antigen or antibody by colloidal gold

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金快速检测试纸条及方法
本专利技术属于生物
的诊断技术的一种试纸条，特别是涉及一种猪圆环病毒2型(PCV2)抗原或抗体的胶体金检测试纸条、制备方法和使用方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(porcinecircovirus2，PCV2)是引起猪断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)的主要病原，引起患畜进行性消瘦、生长缓慢、呼吸困难等症状。此外，PCV2还与猪皮炎与肾病综合征、增生性坏死性肺炎、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍等病的有关。PCV2感染引起的相关的疾病广泛存在于世界范围内，导致的猪死亡率为10％-30％不等，给养猪业造成严重的经济损失。国内外采用的猪圆环病毒2型主要检测方法有病毒分离培养，聚合酶链式反应，间接免疫荧光，酶联免疫吸附试验等。这些方法都可以检测到PCV2的抗原及抗体，但存在操作时间长，过程复杂，需要专业的操作人员及专门的仪器设备等限制条件，难以在基层普及和推广。研制快速、简单及准确的检测方法，对猪群中PCV2病原及抗体水平进行实时监控，对于疾病的预防及控制具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供猪圆环病毒2型(PCV2)抗原及抗体检测胶体金试纸条，可有效检测猪血清中的抗原或抗体，用于PCV2感染的抗原、抗体的诊断。本专利技术的目的是针对我国目前PCV2感染的普遍存在造成巨大经济损失及缺乏有效现场可使用的检测试纸条的现状，提供快速检测的胶体金试纸条，降低检测成本，能大规模应用的现场诊断方法。本专利技术的猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金检测试纸条是通过以下技术方案实现的：一、一种猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金检测试纸条，包括PVC板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、C线和T线，PVC板的上端为吸水垫，作为手持部分；PVC板的中端为反应区，反应区上布置硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜之上布置有金标垫、C线和T线，C线为质控线，T线为检测线，从样品垫到吸水垫方向的硝酸纤维素膜上依次布置金标垫、T线和C线；PVC板的下端为样品垫，作为待检血清样品的区域；所述的金标垫上吸附有金标蛋白；所述的试纸条用于抗原胶体金检测时，金标垫上吸附的金标蛋白为胶体金标记的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白，硝酸纤维膜层上的T线为抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清，C线为山羊抗兔IgG多克隆抗体；所述的试纸条用于抗体胶体金检测时，金标垫上吸附的金标蛋白为胶体金标记的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白，硝酸纤维膜层上的T线为proteinA重组蛋白，C线为抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清。制备试纸条时是将胶体金标记的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白，使其吸附于金标垫上；抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清标记于硝酸纤维素膜上的T线(抗原检测试纸条)或C线(抗体检测试纸条)，将PVC板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序组装完成。具体实施将试纸条各部分组装完毕后，在切割机上将试纸条切割成4mm宽的条带，密封保存备用，以提高试纸条的利用率。所说的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白(简称为CAP重组蛋白)为去核定位信号、带His标签的利用原核表达系统低温诱导表达至上清液的基因工程重组蛋白最后经镍柱纯化获得，所述的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白与猪圆环病毒2型阳性血清特异结合。现有猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金的检测方法对血清里面的抗原量要求很高。本专利技术通过镍柱纯化特殊制备了猪圆环病毒2型CAP重组蛋白，在待检血清样品里面更少量的抗原量情况下，依然能稳定检测出准确结果，提高了识别率，解决了原有少量抗原量识别不出来的技术问题。所说的抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清，为猪圆环病毒2型CAP重组蛋白免疫新西兰大白兔后收集兔血清，再通过CNBr活化琼脂糖凝胶FF偶连猪圆环病毒2型CAP重组蛋白后纯化获得的兔血清。所述的试纸条使用的判断标准为：当能清晰看到T线和C线，T线和C线均为红色，且线条单一、清楚、背景色浅，则判定待检血清样品的检测结果为阳性；当未能清晰看到T线、但能清晰看到C线，C线为红色，则判定待检血清样品的检测结果为阴性；当未能清晰看到T线和C线，即T线和C线均未出现红色，则判定待检血清样品的检测结果无效。所说的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白采用以下方法进行制备：1)设计引物和PCR扩增：利用PCV2序列设计并合成两对引物的四条引物序列，以重组质粒pMD-PCV为模板进行PCR扩增，四条引物序列如下：cap-F1：5-ctggatccaatggcatcttcaacacccgc-3，如SEQIDNO.1；cap-R1：5-agcagggccagaattcaaccttaacctttc-3，如SEQIDNO.2；cap-F2：5-ggttgaattctggccctgctccccaatcac-3，如SEQIDNO.3；cap-R2：5-cccaagctttcacttagggttaagtggggg-3，如SEQIDNO.4；所述的cap-F1和cap-R2分别带有BamHI和HindIII酶切位点。cap-F1、cap-R1、cap-F2、cap-R2的溶液浓度均为0.5μmol/μl。首先，分别将以cap-F1、cap-R1为一组和以cap-F2、cap-R2为一组的两组分别进行第一轮PCR扩增，94℃热启动5分钟，94℃变性45秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环30次，最后72℃延伸10分钟；然后将两组PCR扩增获得的两种产物以1:1溶液质量混合作为第二轮的模板，以F1、R2为引物进行第二轮的融合PCR扩增，94℃变性45秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，循环20次，最后72℃延伸10分钟；最后获得最终PCR扩增产物；2)原核表达载体的构建及诱导表达：将最终PCR扩增产物利用胶回收试纸条大量回收，用BamHI和HindIII双酶切pET32a质粒和最终PCR扩增产物，然后相连接转化至BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，扩繁后加入1mM的IPTG中于16摄氏度摇床进行低温诱导表达，获得培养基；3)重组蛋白的纯化：将培养基以8000g离心力离心5分钟收集菌液，加入7ml的PBS重悬；超声破碎至菌液清澈，再以8000g离心力离心5分钟收集上清液，最后上清液通过镍柱分离纯化目的蛋白，具体实施之后经SDS-PAGE及westernblot分别验证蛋白大小、纯度和抗原性。本专利技术利用大肠杆菌原核表达的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白，制定免疫程序，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，通过CNBr活化琼脂糖凝胶FF偶连猪圆环病毒2型CAP重组蛋白对多克隆抗体进行特异性纯化。所说的抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清，具体制备为：用经镍柱分离纯化制备获得的猪圆环病毒2型CAP重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金检测试纸条，包括PVC板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、C线和T线，PVC板的上端为吸水垫，作为手持部分；PVC板的中端为反应区，反应区上布置硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜之上布置有金标垫、C线和T线，C线为质控线，T线为检测线；PVC板的下端为样品垫，作为待检血清样品的区域；其特征在于：所述的金标垫上吸附有金标蛋白；所述的试纸条用于抗原胶体金检测时，金标垫上吸附的金标蛋白为胶体金标记的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白，硝酸纤维膜层上的T线为抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清，C线为山羊抗兔IgG多克隆抗体；所述的试纸条用于抗体胶体金检测时，金标垫上吸附的金标蛋白为胶体金标记的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白，硝酸纤维膜层上的T线为protein A重组蛋白，C线为抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金检测试纸条，包括PVC板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、C线和T线，PVC板的上端为吸水垫，作为手持部分；PVC板的中端为反应区，反应区上布置硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜之上布置有金标垫、C线和T线，C线为质控线，T线为检测线；PVC板的下端为样品垫，作为待检血清样品的区域；其特征在于：所述的金标垫上吸附有金标蛋白；所述的试纸条用于抗原胶体金检测时，金标垫上吸附的金标蛋白为胶体金标记的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白，硝酸纤维膜层上的T线为抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清，C线为山羊抗兔IgG多克隆抗体；所述的试纸条用于抗体胶体金检测时，金标垫上吸附的金标蛋白为胶体金标记的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白，硝酸纤维膜层上的T线为proteinA重组蛋白，C线为抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清。


2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金检测试剂条，其特征在于：所说的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白为去核定位信号、带His标签的利用原核表达系统低温诱导表达至上清液的重组蛋白最后经镍柱纯化获得，所述的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白与猪圆环病毒2型阳性血清特异结合。


3.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金检测试剂条，其特征在于：所说的抗猪圆环病毒2型CAP重组蛋白多克隆兔血清，为猪圆环病毒2型CAP重组蛋白免疫新西兰大白兔后收集兔血清，再通过CNBr活化琼脂糖凝胶FF偶连猪圆环病毒2型CAP重组蛋白后纯化获得的兔血清。


4.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金检测试剂条，其特征在于：所述的试纸条使用的判断标准为：
当能清晰看到T线和C线，T线和C线均为红色，且线条单一、清楚、背景色浅，则判定待检血清样品的检测结果为阳性；
当未能清晰看到T线、但能清晰看到C线，C线为红色，则判定待检血清样品的检测结果为阴性；
当未能清晰看到T线和C线，即T线和C线均未出现红色，则判定待检血清样品的检测结果无效。


5.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金检测试剂条，其特征在于：所说的猪圆环病毒2型CAP重组蛋白采用以下方法进行制备：
1)设计引物和PCR扩增：
利用PCV2序列设计并合成两对引物的四条引物序列，以重组质粒pMD-PCV为模板进行PCR扩增，四条引物序列如下：
cap-F1：5-ctggatccaatggcatcttcaacacccgc-3，如SEQIDNO.1；
cap-R1：5-agcagggccagaattcaaccttaacctttc-3，如SEQIDNO.2；
cap-F2：5-ggttgaattctggccctgctccccaatcac-3，如SEQIDNO.3；
cap-R2：5-cccaagctttcacttagggttaagtggggg-3，如SEQIDNO.4；
首先，分别将以cap-F1、cap-R1为一组和以cap-F2、cap-R2为一组的两组分别进行第一轮PCR扩增，94℃热启动5分钟，94℃变性45秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环30次，最后72℃延伸10分钟；
然后将两组PCR扩增获得的两种产物以1:1溶液质量混合作为第二轮的模板，以F1、R2为引物进行第二轮的融合PCR扩增，94℃变性45秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，循环20次，最后72℃延伸10分钟；
最后获得最终PCR扩增产物；
2)原核表达载体的构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：卓洵辉，丁豪杰，丁建祖，陆绍红，孔庆明，陈睿，郑斌，童群波，楼涤，
申请(专利权)人：浙江省医学科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33