一种血清淀粉样蛋白A1的胶体金检测卡及其制备方法技术

一种血清淀粉样蛋白A1的胶体金检测卡，属于微生检测技术领域，其特征是：金标结合垫包被有纯化的SAAl抗体与胶体金的偶联标记物，硝酸纤维素膜上平行设有一条包被有SAA1单克隆抗体的SAA1检测线和一条包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。其方法是：步骤一、血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金的偶联标记物的制备，步骤二、试纸条的组装，采用喷金仪将血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金的偶联标记物喷在玻璃纤维素膜上。有益效果是：制备检测血清淀粉样蛋白A1的胶体金检测试纸条并拟应用于临床，具有操作简单快速、检测结果清楚易于判断、特异性强、敏感性高、无需仪器设备等优点，因此，非常适用于现场、门诊等实验条件有限的场所进行临床样品检测。本发明专利技术提供了上述试纸条的制备方法，适用于工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生检测

技术介绍
血清淀粉样蛋白A(serumamyloidAprotein,SAA)是一种急性时相反应蛋白,属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质,相对分子质量约为12000，存在于脊椎动物中，主要由肝细胞合成。SAA是一个多态性的蛋白的总称，由相关但各自独立蛋白的基因（SAA1-SAA4）组成，是脊椎动物的主要急性反应蛋白。血清淀粉样蛋白A1（SAA1）由104个氨基酸组成，SAA1和SAA2有7个氨基酸的差别，它们均为急性期蛋白,其中主要的是SAA1，在炎症反应中起到的作用相似。SAA3基因由于在第3个外显子(第41个密码子处)有1个碱基插入，产生编码位移，导致在第43个密码子处产生翻译终止信号，属于假基因。SAA4在急性期反应不大，出于一个动态平衡状态。研究表明，SAA1在急性和慢性炎症患者血清中含量均有变化。SAA1不仅是慢性阻塞性肺病急性加重期的生物标志物，也是急性心梗、冠心病患者的病情诊断和预后估计具有重要的参考价值。大量的研究表明，在胰腺炎、肝炎、糖尿病、类风湿性关节炎和慢性肾脏疾病病例中，SAA1含量的升高与疾病活动和病程发展有非常密切的关系。目前临床研究表明，所有急性期反应蛋白中，SAA1对急性炎症反应最敏感，升值幅度最大。研究表明，在肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤患者体内SAA1均有不同程度升高，且其水平与肿瘤的活动期、恶性程度及侵袭转移有明显的相关性，反映肿瘤患者的疗效及预后。在急性时相反应中,经白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)刺激,SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成,可升高到最初浓度的100～1000倍。与C反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)类似,SAA是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标,有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。研究表明在病毒感染性急性期,SAA水平明显升高,而CRP升高并不明显,因此SAA是判断病毒感染灵敏而可靠的指标。SAA和CRP联合检测有助于患者细菌感染和病毒感染的鉴别诊断。另外,SAA在诊断病毒感染、肾移植排斥反应患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面比CRP更敏感。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种血清淀粉样蛋白A1的胶体金检测卡及其制备方法，它能够定量、快速、成本低地检测血液中SAA1的含量。本专利技术的技术方案是：包括PVC底板，依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫。金标结合垫包被有纯化的SAAl抗体与胶体金的偶联标记物，硝酸纤维素膜上平行设有一条包被有SAA1单克隆抗体的SAA1检测线和一条包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。本专利技术的制备方法是：步骤一、血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金的偶联标记物的制备：逐级稀释法确定人血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金溶液的用量比例为4.4ug～4.8ug:1ml。按照此用量比例逐滴加入纯化的血清淀粉样蛋白A1抗体，再加入终浓度为1％的牛血清白蛋白，搅拌后获得血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金的偶联标记物，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化；步骤二、试纸条的组装：采用喷金仪将血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金的偶联标记物喷在玻璃纤维素膜上，室温37℃条件下自然干燥，密封，获得金标结合垫；采用划膜仪将纯化的SAA1单克隆抗体、羊抗鼠IgG分别划膜于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上；将处理好的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜依次粘帖在PVC底板上，切条、组装、密封，获得血清淀粉样蛋白A1胶体金检测试纸条，室温保存。进一步的，所述胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备：取1％氯金酸溶液1ml，加入99ml的超纯水配置成终浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠1ml并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热10分钟，室温冷却，获得胶体金溶液，4℃保存备用，胶体金颗粒直径为40nm。进一步的，步骤一中，述逐级稀释法确定血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金溶液的用量比例的具体过程如下：用0.1mol/L的碳酸盐溶液调节胶体金溶液的PH值为8.5，向11支离心管中分别加入1ml胶体金溶液；将血清淀粉样蛋白A1抗体逐级稀释后即含量分别为1ug、2ug、4ug、8ug、10ug、12ug、14ug、16ug、18ug、20ug，按照上述顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，10分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1ml混匀，室温静置2小时以上观察结果，1号管为空白对照；2号、3号、9号管至11号管中，出现由红变蓝的聚沉现象，4号管至8号管中，保持胶体金的红色不变；因此，胶体金红色不变且血清淀粉样蛋白A1抗体加入量最低的离心管即4号管中的血清淀粉样蛋白A1抗体含量，即为稳定1ml胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1ml胶体金溶液所需的血清淀粉样蛋白A1抗体1的实际使用量，即血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金溶液的用量比例为：4.4ug～4.8ug:1ml。进一步的，步骤一中，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化的具体过程如下：首先将体积为V的血清淀粉样蛋白A1抗体在4℃下以3000rpm/min离心30分钟，吸取上清液，弃沉淀；再将上清液在4℃下以10000rpm/min离心30分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即血清淀粉样蛋白A1抗体的体积V，稳定后过夜：4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟，弃上清，用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即血清淀粉样蛋白A1抗体的体积V的1/10，获得纯化的血清淀粉样蛋白A1抗体，4℃保存备用；所述PBS缓冲液中含有1％BSA和0.02％叠氮钠。本专利技术的有益效果是：将酶联免疫原理与胶体金层析技术结合，制备检测血清淀粉样蛋白A1的胶体金检测试纸条并拟应用于临床，具有操作简单快速、检测结果清楚易于判断、特异性强、敏感性高、无需仪器设备等优点，因此，非常适用于现场、门诊等实验条件有限的场所进行临床样品检测。本专利技术提供了上述试纸条的制备方法，适用于工业生产。附图说明图1为本专利技术的血清淀粉样蛋白A1胶体金检测试纸条的结构示意图。图2为本专利技术的血清淀粉样蛋白A1胶体金检测试纸条阳性结果判定示意图。图3为本专利技术的血清淀粉样蛋白A1胶体金检测试纸条阴性结果判定示意图。图4为本专利技术的血清淀粉样蛋白A1胶体金检测试纸条无效结果判定示意图。具体实施方式图中：1是PVC底板，2是样品垫，3是金标结合垫，4是硝酸纤维素膜，5是检测线，6是质控线，7是吸收垫。本专利技术的血清淀粉样蛋白A1胶体金检测试纸条，包括PVC底板1、样品垫2、金标结合垫3、带有检测线5和质控线6的硝酸纤维素膜4和吸收垫7，样品垫2、金标结合垫3、带有检测线5和质控线6的硝酸纤维素膜4、吸收垫7依次粘帖在PVC底板1上，金标结合垫3包被有纯血清淀粉样蛋白A1胶体金的偶联标记物，硝酸纤维本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血清淀粉样蛋白A1的胶体金检测卡，其特征是：金标结合垫包被有纯化的SAAl 抗体与胶体金的偶联标记物，硝酸纤维素膜上平行设有一条包被有SAA1单克隆抗体的SAA1检测线和一条包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。

【技术特征摘要】
1.一种血清淀粉样蛋白A1的胶体金检测卡，其特征是：金标结合垫包被有纯化的SAAl抗体与胶体金的偶联标记物，硝酸纤维素膜上平行设有一条包被有SAA1单克隆抗体的SAA1检测线和一条包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。2.一种血清淀粉样蛋白A1的胶体金检测卡的制备方法，其方法是：步骤一、血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金的偶联标记物的制备，逐级稀释法确定人血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金溶液的用量比例为4.4ug～4.8ug:1ml；按照此用量比例逐滴加入纯化的血清淀粉样蛋白A1抗体，再加入终浓度为1％的牛血清白蛋白，搅拌后获得血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金的偶联标记物，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化；步骤二、试纸条的组装，采用喷金仪将血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金的偶联标记物喷在玻璃纤维素膜上，室温37℃条件下自然干燥，密封，获得金标结合垫；采用划膜仪将纯化的SAA1单克隆抗体、羊抗鼠IgG分别划膜于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上；将处理好的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜依次粘帖在PVC底板上，切条、组装、密封，获得血清淀粉样蛋白A1胶体金检测试纸条，室温保存；进一步的，所述胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备，取1％氯金酸溶液1ml，加入99ml的超纯水配置成终浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠1ml并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热10分钟，室温冷却，获得胶体金溶液，4℃保存备用，胶体金颗粒直径为40nm；进一步的，步骤一中，述逐级稀释法确定血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金溶液的用量比例的具体过程如下，用0.1mol/L的碳酸盐溶液调节胶体金溶液的PH值为8.5，向11支离心管中分别加入1ml胶体金溶液；将血清淀粉样蛋白A1抗体逐级稀释后即含量分别为1ug、2ug、4ug、8ug、10ug、12ug、14ug、16ug、18ug、20ug，按照上述顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，10分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1ml混匀，室温静置2小时以上观察结果，1号管为空白对照；2号、3号、9号管至11号管中，出现由红变蓝的聚沉现象，4号管至8号管中，保持胶体金的红色不变；因此，胶体金红色不变且血清淀粉样蛋白A1抗体加入量最低的离心管即4号管中的血清淀粉样蛋白A1抗体含量，即为稳定1ml胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1ml胶体金溶液所需的血清淀粉样蛋白A1抗体1的实际使用量，即血清淀粉样蛋白A1抗体与胶体金溶液的用量比例为：4.4ug～4.8ug:1ml；进一步的，步骤一中，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化的具体过程如下，首先将体积为V的血清淀粉样蛋白A1抗体在4℃下以3000rpm/min离心30分钟，吸取上清液，弃沉淀；再将上清液在4℃下以10000rpm/min离心30分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即血清淀粉样蛋白A1抗体的体积V，稳定后过夜至4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟...

【专利技术属性】
技术研发人员：于源华，赵玉环，徐水波，赵凤胜，王迪，张洋，张起莹，丁秋雨，徐蕾，孟贺喜，
申请(专利权)人：长春理工大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22