本发明专利技术公开了一种检测HE4的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用，该光电化学免疫传感器由由Nb2共价结合到MWCNTs‑PDA‑AuNPs修饰后的基底电极上，HE4抗原与Nb2特异性结合，Nb3@nPCN‑224与HE4抗原特异性结合制得。本发明专利技术利用光电化学免疫法提高了传感器的抗干扰性，同时使用的光活性物质nPCN‑224具有很好的生物相容性，可以负载大量的生物分子，还具有很强的光电活性，以此来提高传感器的灵敏度。本发明专利技术制备的光电免疫传感器，操作简单，反应迅速，灵敏度高，抗干扰性强，稳定性佳，能够实现对于痕量抗原HE4的检测，为开发出用于临床诊断的优异平台提供了新思路。
【技术实现步骤摘要】
一种检测HE4的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及一种检测HE4的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。对卵巢癌的早期诊断有助于病人的及时治疗从而提高病人的存活率，但由于卵巢深居盆腔，体积小，缺乏典型症状，难以早期发现，所以早期诊断是一大难题。在肿瘤发展的过程中，肿瘤组织或细胞会释放出一些特异性的蛋白质进入循环体系，而这些特异性蛋白在血液中的含量水平标志着肿瘤发展的阶段，所以在生物医学上常将这些特异性蛋白称为肿瘤标记物。而尽早的检测出肿瘤标记物是影响癌症患者恢复的关键因素。HE4是一种新型的卵巢癌特异性肿瘤标志物，研究表明尤其在早期阶段，HE4的特异性和灵敏度要高于常见标志物CA125，所以实现对HE4的高特异性和高灵敏度的检测在卵巢癌的医学研究和检测方面及其重要。目前，对HE4的常用检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)，酶免疫分析法(EIA)和放射免疫分析法(IRMA)等，但这些方法大多仪器昂贵，操作复杂、耗时。光电化学分析是一种基于光电化学活性物质的光电信号转换而进行检测的一种分析方法，其成本低、设备简单、易于微型化、背景信号低，可降低检测下限，已广泛应用于DNA分析，细胞检测和酶传感中，当然光电免疫分析用于标志物的检测不仅可以利用光电化学分析的优点，还可以可提高检测的灵敏度和特异性。另外，光电活性材料在光电免疫分析中扮演着很重要的角色，MOF作为一种有机-无机杂化材料，其多孔性强，比表面积大，具有结构与功能的多样性，可用于标记生物分子。同时，卟啉基MOF是一种很好的光电活性物质，光的吸收效率高。另外，可以通过改变MOF合成的条件来调控MOF的尺寸，nMOFs和microsizedMOFs相比更适用于传感器的信号转导。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于具有稳定和高光电活性物质nPCN-224的光电化学免疫传感器用于卵巢癌标志物HE4的检测，该光电化学免疫传感器操作简便，灵敏度高，稳定性佳，选择性好，能够实现对于痕量HE4抗原的检测，为定量检测HE4提供了有效的工具。本专利技术制备的传感器为Nb3@nPCN-224/Ag/Nb2/M-P-A/ITO，后将此传感器放入电解液中进行光电检测。本专利技术的另一个目的是提供所述检测HE4的光电化学免疫传感器的制备方法。本专利技术的另一个目的是提供所述检测HE4的光电化学免疫传感器的应用。本专利技术中技术术语的缩写如下：多壁碳纳米管：MWCNTs；盐酸多巴胺：DA；聚多巴胺：PDA；金纳米粒子：AuNPs；meso-四(对-羧基苯基)卟啉：H2TCPP；苯甲酸：BA；人附睾蛋白4：HE4；HE4纳米抗体：Nb2，Nb3；牛血清蛋白：BSA；氧化铟锡半导体电极：ITO。本专利技术中的原料中的捕获抗体：Nb2和标记抗体：Nb3按照文献HighlySelectiveandSensitiveElectrochemicalImmunoassayofCry1CUsingNanobodyandπ-πStackedGrapheneOxide/ThionineAssembly(Anal.Chem.2016,88,9830-9836)合成。此外，其他原料均由市售可得。其中多壁碳纳米管MWCNTs购置于先丰纳米材料科技有限公司(为羧基化的MWCNTs)；盐酸多巴胺DA购置于百灵威科技有限公司；附睾蛋白HE4抗原购置于北京义翘神州科技有限公司；H2TCPP购置于Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇有限公司。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种检测HE4的光电化学免疫传感器，其特征在于，由Nb2共价结合到MWCNTs-PDA-AuNPs修饰后的基底电极上，HE4抗原与Nb2特异性结合，Nb3@nPCN-224与HE4抗原特异性结合制得。作为优选，所述基底电极为氧化铟锡半导体电极。其中，所述MWCNTs-PDA-AuNPs由DA加入到MWCNTs的分散液中(溶剂为水)，搅拌反应生成MWCNTs-PDA分散液，后将HAuCl4和Na3C6H5O7·2H2O加入到MWCNTs-PDA的分散液中反应生成MWCNTs-PDA-AuNPs分散液。优选地，所述的MWCNTs-PDA-AuNPs由以下方法制备而成：称取5-20mg羧基化MWCNTs分散于8-10mL的1×Tris-HCl缓冲液中，后加入0.5-2mL10-40mg/mL的DA溶液(溶剂为1×Tris-HCl缓冲液)，避光反应18-30h，离心洗涤得MWCNTs-PDA，后分散于20-30mLH2O中，调节其pH至4.0-6.0，接着加入300-400μL0.05-0.2M的氯金酸水溶液，后缓慢加入4-6mL0.05-0.2M现配的柠檬酸钠水溶液，反应1-3h，离心洗涤得MWCNT-PDA-AuNPs。其中，所述Nb3@nPCN-224由H2TCPP、ZrOCl2·8H2O和BA溶于DMF中，加热(水热法)反应得到nPCN-224，后用NHS和EDC的混合液进行活化，接着用Nb3标记nPCN-224，即得Nb3@nPCN-224。优选地，所述的Nb3@nPCN-224由以下方法制备而成：(1)nPCN-224的合成：将5-20mgH2TCPP、20-40mgZrOCl2·8H2O和250-300mgBA溶于5-20mLDMF中，加热反应，得到紫色固体为nPCN-224，离心洗涤，溶于DMF中形成分散液备用；(2)Nb3@nPCN-224的合成：将100-300μL的50-200μg/mLNb3的PBS溶液加入到活化后的nPCN-224的分散液中，孵育培养，然后加入BSA溶液封闭，离心，PBS溶液洗涤，最后分散在PBS溶液中保存，即为Nb3@nPCN-224。步骤(1)中，加热温度为80-100℃，优选为90℃。加热时间为2-4h，优选为3h。步骤(2)中，所述的PBS溶液为0.01MpH＝7.4的PBS溶液。孵育温度为3.8-4.2℃，优选为4℃。孵育时间为10-14h，优选为12h。BSA的质量分数为0.5-5％，优选为1％，溶剂为0.01MpH＝7.4的PBS溶液。封闭温度为25-37℃，优选为37℃。封闭时间为20-40min，优选为30min。本专利技术所述的检测HE4的光电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)基底材料固定：将MWCNTs-PDA-AuNPs分散液滴涂在ITO表面，干燥后用超纯水清洗，晾干；(2)锚定识别分子：向步骤(1)得到的基底电极表面滴加EDC/NHS的混合液，室温放置后用PBS溶液清洗，清洗后将识别分子捕获抗体Nb2滴加到基底电极上，孵育后用PBS溶液清洗；(3)非特异性位点封闭：向步骤(2)得到的电极表面滴加BSA溶液，25-37℃下封闭0.5-1h，后用PBS溶液清洗；(4)孵育目标分子HE4：将H本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测HE4的光电化学免疫传感器，其特征在于，由Nb2共价结合到MWCNTs-PDA-AuNPs修饰后的基底电极上，HE4抗原与Nb2特异性结合，Nb3@nPCN-224与HE4抗原特异性结合制得。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测HE4的光电化学免疫传感器，其特征在于，由Nb2共价结合到MWCNTs-PDA-AuNPs修饰后的基底电极上，HE4抗原与Nb2特异性结合，Nb3@nPCN-224与HE4抗原特异性结合制得。
2.根据权利要求1所述的光电化学免疫传感器，其特征在于，所述基底电极为氧化铟锡半导体电极。
3.根据权利要求1所述的光电化学免疫传感器，其特征在于，所述MWCNTs-PDA-AuNPs由DA加入到MWCNTs的分散液中，搅拌反应生成MWCNTs-PDA分散液，后将HAuCl4和Na3C6H5O7·2H2O加入到MWCNTs-PDA的分散液中反应生成MWCNTs-PDA-AuNPs。
4.根据权利要求1所述的光电化学免疫传感器，其特征在于，所述Nb3@nPCN-224由H2TCPP、ZrOCl2·8H2O和BA溶于DMF中，加热反应得到nPCN-224，用Nb3标记nPCN-224，即得Nb3@nPCN-224。
5.一种权利要求1所述的检测HE4的光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)基底材料固定：将MWCNTs-PDA-AuNPs分散液滴涂在ITO表面，干燥后用超纯水清洗，晾干；
(2)锚定识别分子：向步骤(1)得到的基底电极表面滴加EDC/NHS的混合液，室温放置后用PBS溶液清洗，清洗后将识别分子捕获抗体Nb2滴加到基底电极上，孵育后用...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈艳飞，陈开洋，张越，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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