检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体制造技术

本发明专利技术涉及一种检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，该抗体为多克隆抗体，抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述抗体的制备方法：采用多肽合成技术，合成SEQ ID No.1所示抗体的多肽，然后与血蓝蛋白KLH交联，得到抗原；将抗原与完全佐剂或者不完全佐剂混合后注入动物体内免疫8次，取动物全血，进行纯化，即得。本发明专利技术人研究发现，EZH2的R342位能够被PRMT1进行非对称性二甲基化修饰，并能显著增强EZH2的蛋白稳定性，本发明专利技术提供的抗体能有效的特异性识别EZH2中R342位的非对称性二甲基化修饰情况，对于今后研究EZH2蛋白翻译后修饰的调控，有至关重要的作用。

Detection of antibody modified by asymmetric dimethylation at r342 site of EZH2

【技术实现步骤摘要】
检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体
本专利技术涉及一种检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，属于生物

技术介绍
EZH2(EnhancerofZesteHomolog2)是一个重要的组蛋白甲基转移酶，能够催化其靶基因的组蛋白H3第27位赖氨酸发生三甲基化修饰(H3K27me3)。人源EZH2是一个包含有20个外显子长约40kb的基因。EZH2基因编码产生一个约100KD大小的蛋白，包含746个氨基酸残基，在人和小鼠等多个物种间序列保守性很强。随着研究的深入，越来越多的研究报道发现EZH2蛋白的翻译后修饰(Post-TranslationalModification，PTM)对其多种生物学功能的发挥起着重要作用。目前已知的EZH2翻译后修饰主要集中在EZH2蛋白的磷酸化、乙酰化、糖基化和泛素化修饰，EZH2的甲基化修饰研究很少。精氨酸甲基转移酶(ProteinArginineMethyltransferases,PRMTs)是一类能够对组蛋白和非组蛋白精氨酸残基进行甲基化修饰的酶。精氨酸甲基转移酶PRMTs(ProteinArginineMethyltransferases,PRMTs)能够催化来自S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基团转移到精氨酸胍基的氮原子上，可以形成三种类型的精氨酸甲基化修饰：单甲基化(MMA)、非对称性二甲基化(ADMA)和对称性二甲基化(SDMA)。蛋白的精氨酸非对称性二甲基化修饰是一种非常重要的翻译后修饰类型，在细胞核和细胞质中均发现许多受精氨酸非对称性二甲基化修饰的蛋白。例如，PRMT1介导Twist的34位精氨酸发生非对称性二甲基化修饰，可抑制E-cadherin表达，促进肺癌细胞的转移；PRMT1催化C/EBPα的35、156和165位精氨酸发生非对称性二甲基化修饰，可促进cyclinD1表达，促进乳腺癌肿瘤形成，等等。EZH2是否能够发生精氨酸非对称性二甲基化修饰，迄今为止还没有相关的任何研究报道，也没有检测EZH2非对称性二甲基化修饰的抗体报道。本专利技术人研究发现精氨酸甲基转移酶1(ProteinArginineMethyltransferases1，PRMT1)能够催化EZH2的R342精氨酸发生非对称性二甲基化修饰，并且修饰后能够增强EZH2蛋白稳定性，从而导致EZH2在癌细胞中高表达，因此迫切需要一种用于检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，来检测EZH2的R342位点的非对称性二甲基化修饰。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，可以实现对EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的快速特异性检测。本专利技术的另一目的在于提供上述抗体的制备方法。技术方案PRMT1是PRMTs家族中酶活性最高的精氨酸甲基转移酶，也是最主要的I类PRMT酶，细胞内85％的精氨酸非对称性二甲基化修饰都是由PRMT1介导产生的。专利技术人发现PRMT1能够对EZH2的R342位点进行非对称性二甲基化修饰。本专利技术人运用纯化的GST-EZH2和GST-PRMT1蛋白，通过体外3H-SAM放射自显影实验，检测发现EZH2能够被PRMT1进行直接的甲基化修饰，并进一步通过质谱检测分析发现：EZH2-R342能够进行非对称性二甲基化修饰。一种检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，所述抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1(TAERIKTPPKRPGGC)所示。进一步，所述抗体为多克隆抗体。上述抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)采用多肽合成技术，合成氨基酸序列如SEQIDNo.1所示抗体的多肽，然后与血蓝蛋白KLH交联，得到抗原；(2)将抗原与完全佐剂(CFA)或者不完全佐剂(IFA)混合后注入动物体内进行免疫，免疫8次后，取动物全血，进行纯化，得到抗体。进一步，步骤(2)中，抗原与完全佐剂(CFA)或者不完全佐剂(IFA)的体积比为1:1。进一步，步骤(2)中，所述动物为新西兰大白兔，所述免疫的方法：对新西兰大白兔进行阴性血采集及第一次免疫(0天)；第二周进行第二次免疫；第四周进行第三次免疫；第五周进行第四次免疫；第六周进行第五次免疫；第七周进行第六次免疫；第八周进行第七次免疫；第九周进行第八次免疫；最后在第十周取动物全血；第一次和第二次免疫，抗原的体积为0.5mL，抗原的质量为0.25mg；第三次到第八次免疫，抗原的体积为0.3mL,抗原的质量为0.15mg。进一步，步骤(2)中，所述纯化的方法，包括如下步骤：1)取抗原亲和层析柱，用缓冲液TEbuffer平衡柱床；2)将需纯化抗体按1-2ml/min的速度上样于相应的层析柱，反复上样4-5遍使能与多肽发生特异性结合的抗体吸附在柱床上；3)上样完毕，用缓冲液TEbuffer平衡柱床；4)用洗脱液glycinebuffer以1-2ml/min的速度洗脱结合在柱床上的抗体；5)样品收集完毕，用缓冲液TEbuffer平衡柱床；6)用洗脱液glycinebuffer清洗柱床；7)再次用TEbuffer平衡柱床，置于4℃保存；8)将洗脱得到的抗体用PBSbuffer透析48h后，即得纯化后的抗体。本专利技术的有益效果：本专利技术人经实验证实，EZH2的R342位能够被PRMT1进行非对称性二甲基化修饰，并能显著增强EZH2的蛋白稳定性，这对于全面了解EZH2的翻译后修饰网络具有重要意义。本专利技术提供的抗体(meR342-EZH2抗体)能有效的特异性识别EZH2中R342位的非对称性二甲基化修饰情况，对于今后研究EZH2蛋白翻译后修饰的调控，有至关重要的作用。附图说明图1为GSTpulldown实验的结果；图2为GST-PRMT1分别和GST-EZH2(1-522AA)和GST-EZH2(523-746AA)反应后的体外甲基化检测结果；图3为Flag-EZH2-WT过表达的HEK293T细胞和Flag-EZH2-R342K过表达的HEK293T细胞分别用MG132处理后的EZH2蛋白的表达量变化的WesternBlot检测结果；图4为Flag-EZH2-WT过表达的HEK293T细胞和Flag-EZH2-R342K过表达的HEK293T细胞分别用CHX处理后的EZH2蛋白半衰期变化的WesternBlot检测结果；图5为meR342-EZH2抗体的Dot-Blot检测结果；图6为meR342-EZH2抗体识别Flag-EZH2-WT和Flag-EZH2-R342K蛋白中meR342-EZH2甲基化的WesternBlot检测结果；图7为meR342-EZH2抗体识别EZH2-R342位点非对称性二甲基化修饰的免疫组化检测结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。下述实施例中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.如权利要求1所述检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体。


3.权利要求1或2所述抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用多肽合成技术，合成氨基酸序列如SEQIDNo.1所示抗体的多肽，然后与血蓝蛋白KLH交联，得到抗原；
(2)将抗原与完全佐剂或者不完全佐剂混合后注入动物体内进行免疫，免疫8次后，取动物全血，进行纯化，得到抗体。


4.如权利要求3所述抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，抗原与完全佐剂或者不完全佐剂的体积比为1:1。


5.如权利要求3所述抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述动物为新西兰大白兔，所述免疫的方法：对新西兰大白兔进行阴性血采集及第一次免疫(0天)；第二周进行第二次免疫；第四周进行第三次免疫；第五周进行第四次免疫；第六周进行第五...

【专利技术属性】
技术研发人员：李中伟，白津，郑骏年，王典典，侯平甫，李敏乐，柴大飞，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32