一种腐败检材降解DNA的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种腐败检材降解DNA的检测方法，包括以下步骤：a）获取人体血液组织位于核小体核心区域DNA；b）对所述核小体核心区域DNA进行测序；c）将测序得到的序列与人类基因组序列信息进行比对，筛选，获得了核小体核心区域SNVs、Indels或STRs遗传标记；d）根据所述SNVs、Indels或STRs遗传标记的序列设计上、下游引物；e）提取腐败检材的DNA；f）用所述上、下游引物对所述腐败检材的DNA进行PCR扩增，得扩增产物；g）对所述扩增产物电泳，根据扩增获得的每个基因座进行分型分析。本发明专利技术利用核小体核心区域的遗传标记对腐败检材降解DNA进行检测，其基因座的检出率更高、获得的检测信息更为全面，使得其在法医鉴定和考古分析中得出更为准确、可靠的结论。

【技术实现步骤摘要】
一种腐败检材降解DNA的检测方法及其应用
本专利技术涉及法医学DNA的检测领域，具体地说是一种腐败检材降解DNA的检测方法及其应用。
技术介绍
在死、伤案件的侦破中，经常遇到腐败生物检材，由于检材中的DNA严重降解，若采用常规的试剂盒检测，会出现所得结果不完整或重复性差，其图谱可见ladder带和stutter带，等位基因扩增不平衡、位点丢失，扩增的基因座信号很弱、根本无法判型等现象，导致该类案件侦破率较低。目前，常用检测降解DNA的MiniSTR和SNP扩增体系虽能解决部分难题，但仍然存在等位基因丢失、基因座的检出率低下，获得的检出信息全面性和准确度较差，而这些问题也正是现阶段国际法医DNA检验中存在的却无法解决的技术瓶颈。因此，能够研发一种高检出率、可以广泛应用于腐败生物检材降解DNA分型的全体系基因位点的检测技术，是当前法医行业和考古领域亟待解决的问题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种腐败检材降解DNA的检测方法及其应用，以提供一种用于腐败检材降解DNA的检测新技术，以解决现有检测方法对于检测腐败检材降解DNA存在等位基因丢失、基因座检测率较低的问题。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种腐败检材降解DNA的检测方法，包括以下步骤：a）获取人体血液组织位于核小体核心区域DNA；b）对所述核小体核心区域DNA进行测序；c）将测序得到的序列与人类基因组序列信息进行比对，筛选，获得SNVs、Indels或STRs遗传标记；d）根据所述SNVs、Indels或STRs遗传标记的序列设计上、下游引物；e）提取腐败检材的DNA；f）用设计的所述上、下游引物对所述腐败检材的DNA进行PCR扩增，得扩增产物；g）对所述扩增产物电泳，根据扩增获得的每个基因座进行分型分析。本专利技术将所述测序获得的序列与样本已知基因组库序列信息进行比对时，每条测序获得的序列与人类基因组序列比对不多于3个碱基错配的为有效序列，可用于进一步筛选。本专利技术所述SNVs遗传标记和Indels遗传标记均采用samtools和varscan软件进行筛选，发现和过滤基因组变异的遗传标记，分别获得了2462个SNVs遗传标记和128个Indels遗传标记。本专利技术所述STRs遗传标记通过自行编写计算机程序进行筛选，运行程序的编程条件为：①允许有0个碱基错配；②STR重复单位的基序长度为3bp、4bp或者5bp；③STR重复单位的重复次数大于5；④对于重复单元相同的所有潜在STR，取出其两翼序列，两翼序列有任意一端长度小于10bp的过滤掉；⑤对两翼序列分别两两比较，潜在STR往左右分别取10bp，完全相同的认定为同一个STR；⑥一个STR有3个及以上的序列支持，认定该STR遗传标记为真实存在的有效序列；全部满足以上6个条件的序列为有效STRs遗传标记。由该方法筛选到了10167个STRs遗传标记，其部分序列见序列表。本专利技术中从所筛选到的核小体核心区域STRs遗传标记中选用了部分标记进行对腐败检材降解DNA进行检测，并以非核小体核心区域STRs遗传标记作为对比例，检测结果表明，对于在一定降解程度的腐败检材，采用核小体核心区域的遗传标记检测腐败检材降解DNA，其基因座的检出率较非核小体核心区域遗传标记的检出率平均高出38%，同时，根据核小体核心区域的遗传标记与非核小体核心区域的遗传标记抗降解性能的实验证明，核小体核心区域的遗传标记的抗降解性能更高，由此证明，利用核小体核心区域遗传标记能够在腐败检材降解DNA法医检测中得到很好地应用，可以作为新一代腐败生物检材降解DNA分型全体系基因位点扩增技术的遗传标记，并在检测中可以获得基因座的更高检出率和更为全面可信的检测信息，由此解决了法医鉴定和考古分析中由于检材中的DNA严重降解使得检测结果不完整或重复性差，导致一部分案件无法侦破的难题。本专利技术所述核小体核心区域遗传标记为核小体核心区域的SNVs遗传标记、Indels遗传标记或STRs遗传标记中的任意一个遗传位点。所述STRs遗传标记为D10S1248、D18S51、TH01、TPOX或DYS391中的任意一个。所述D10S1248遗传标记的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，扩增所述D10S1248遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:11、下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:12；所述D18S51遗传标记的核苷酸序列为SEQIDNO:2，扩增所述D18S51遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:13、下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:14；所述TH01遗传标记的核苷酸序列为SEQIDNO:3，扩增所述TH01遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:15、下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:16；所述TPOX遗传标记的核苷酸序列为SEQIDNO:4，扩增所述TPOX遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:17、下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:18；所述DYS391遗传标记的核苷酸序列为SEQIDNO:5，扩增所述DYS391遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:19、下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:20。本专利技术使用二代高通量测序技术对人类白细胞核小体核心区域三种多态性遗传标记进行筛选，筛选结果准确，能满足法医学检案之急需；同时，本专利技术所获核小体核心区遗传标记具有较高法医学应用价值，可以进一步开发为针对降解检材分析的商品化试剂盒，应用于法医学检案或考古学领域的家族溯源。本专利技术的创造性贡献在于首次提出了利用核小体核心区域的遗传标记来检测腐败检材降解DNA，而且通过实验证明，该方法检测一定降解程度的腐败检材，其基因座的平均检出率高达64%，这在案件侦查过程中，可以获得更为全面的检测信息，使得其在法医鉴定和考古分析中得到更为准确、可靠的结论，更有利于一些疑难案件的分析和侦破。附图说明图1为样本在DNaseI消化各时间点的相对DNA含量。图2为人工降解检材中核小体组STRs与非核小体组STRs的基因座检出率。虚线表示两组的平均基因座检出率。图3为20例人工降解检材中单个基因座检出率分析。图4为采用核小体组STRs遗传标记和非核小体组STRs遗传标记检测福尔马林固定样本基因座的检出率。虚线表示两组的平均基因座检出率。图5为采用核小体组STRs遗传标记和非核小体组STRs遗传标记检测不同福尔马林固定时长的基因座检出率。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1获取位于核小体核心区域的DNA遗传标记其DNA遗传标记包括SNVs（单核苷酸变异位点），Indels（插入缺失多态性位点），STRs（短串联重复序列多态性位点）。实验方法：（1）从健康人外周血收集白细胞，使用微球菌核酸酶（micrococcalnuclease，MNase）对血液裂解后的白细胞进行消化；加入终浓度为1mM的CaCl2溶液和终浓度为3U/ul的微球菌核酸酶，于37℃下孵育3h以释放核小体核心部分，使用酚氯仿法提取消化后白细胞中DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腐败检材降解DNA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a)获取人体血液组织中位于核小体核心区域DNA；b)对所述核小体核心区域DNA进行测序；c)将测序得到的序列与人类基因组序列信息进行比对，筛选，获得了核小体核心区域SNVs、Indels或STRs遗传标记；d)根据所述SNVs、Indels或STRs遗传标记的序列设计上、下游引物；e)提取腐败检材的DNA；f)用设计的所述上、下游引物对所述腐败检材的DNA进行PCR扩增，得扩增产物；g)对所述扩增产物电泳，根据扩增获得的每个基因座进行分析。

【技术特征摘要】
1.一种核小体核心区域遗传标记的检测方法在腐败检材降解DNA法医检测中的应用；其特征在于，遗传标记的检测方法包括以下步骤：a）获取人体血液组织中位于核小体核心区域DNA；b）对所述核小体核心区域DNA进行测序；c）将测序得到的序列与人类基因组序列信息进行比对，筛选，获得了核小体核心区域STRs遗传标记；d）根据所述STRs遗传标记的序列设计上、下游引物；e）提取腐败检材的DNA；f）用设计的上、下游引物对所述腐败检材的DNA进行PCR扩增，得扩增产物；g）对所述扩增产物电泳，根据扩增获得的每个基因座进行分析；所述STRs遗传标记为D10S1248、D18S51、TH01、TPOX或DYS391中的任意一个；所述D10S1248遗传标记的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，扩增所述D10S1248遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:11、下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:12；所述D18S51遗传标记的核苷酸序列为SEQIDNO:2，扩增所述D18S51遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:13、下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:14；所述TH01遗传标记的核苷酸序列为SEQIDNO:3，扩增所述TH01遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:15、下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:16；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛斌，董春楠，李淑瑾，马春玲，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：河北;13