一种基因疫苗载体、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基因疫苗载体、其制备方法及应用，该基因疫苗载体是磷酸酶催化小分子多肽形成的超分子水凝胶，所述小分子多肽的结构式如式（I）所示：，其中，m=1时，n=0、1、2或3；n=1时，m=1、2或3。该基因疫苗载体负载DNA后的免疫原性强、负载量大、没有明显毒性并可注射免疫。本发明专利技术的基因疫苗载体制备条件温和并且过程简单。

【技术实现步骤摘要】
一种基因疫苗载体、其制备方法及应用
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种基因疫苗载体、其制备方法及应用。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，HIV）已经引起超过3千万人的死亡，发展一种高效的疫苗防止HIV的感染成为人们迫切的需要。除此之外，譬如乙肝、丙肝以及流感等传统的疫苗的效率很低并会引来潜在的风险，所以安全的替代物如基因疫苗引起广泛的注意。基因疫苗十分安全并且可以产生长期的细胞免疫和体液免疫应答，但是基因疫苗的免疫原性很低，需要通过一种载体输送到体内增强免疫应答。已有的载体包括高分子、脂质体以及纳米或微米颗粒等。高分子如聚醚酰亚胺（Polyetherimide，PEI）具有较大的毒性(Lim,M.H.,etal.(2007).Accountsofchemicalresearch40(1):41-51)；脂质体的抗原负载量比较小(Malmsten,M.(2006).Softmatter2(9):760-769.)；纳米或微米颗粒如二氧化硅小球或微乳液制备复杂，在制备过程中存在的有机溶剂、高剪切力及超声等条件易使DNA活性下降（Ando,S.,etal.(1999).JournalofPharmaceuticalSciences88(1):126-130；Walter,E.,etal.(1999).JournalofControlledRelease61(3):361-374；Gemeinhart,R.A.,etal.(2005).BiotechnologyProgress21(2):532-537.）。水凝胶虽然具有比较好的生物相容性，但是传统的水凝胶不可直接注射使用，需要原位成胶用于载药，虽然可局部释药，但是未反应的单体会造成毒性（Altunbas,A.,etal.(2011).Biomaterials32(25):5906-5914.）。因此，如何找到一种安全、高效负载、制备简单且不降低疫苗活性、可注射的基因疫苗载体仍然是一个挑战。超分子水凝胶是由分子量小于2000的小分子通过自组装在水溶液中形成的水凝胶（Aida,T.,etal.(2012).Science335(6070):813-817.）。这种水凝胶成胶方法多样，可快速对pH、离子强度及温度等进行响应，形成水凝胶（Hartgerink,J.D.,etal.(2002).ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences99(8):5133-5138.）。在这些方法中，酶催化的成胶反应具有独特的优点，具有高选择性，可在生理条件下或者温和条件下快速成胶，从而避免了DNA生物活性的降低（Yang,Z.,etal.(2008).Accountsofchemicalresearch41(2):315-326.）。此外超分子水凝胶可以多种方式注射到体内，皮下或腹腔给动物注射超分子水凝胶均没有显示出急性或长期毒性（Yang,Z.,etal.(2006).JournaloftheAmericanChemicalSociety128(9):3038-3043.）。中国专利申请（申请号为：200910229186.7）涉及一系列用于生成稳定小分子水凝胶的多肽衍生物的合成方法，但是没有涉及这种小分子水凝胶的应用。
技术实现思路
本专利技术人通过大量实验和创造性劳动，制得了一种基因疫苗载体，并证实该基因疫苗载体负载DNA后的免疫原性强、负载量大、没有明显毒性并可注射免疫。本专利技术的基因疫苗载体制备条件温和并且过程简单。本专利技术可通过肌肉注射、皮内注射或皮下注射的方式对人或动物进行HIV、乙肝、丙肝和流感病毒等病毒的免疫。本专利技术采用以下技术方案：在第一方面，本专利技术提供一种基因疫苗载体，其是磷酸酶催化小分子多肽形成的超分子水凝胶，所述小分子多肽的结构式如式（I）所示：其中，m=1时，n=0、1、2或3；n=1时，m=1、2或3。在本专利技术一个实施方案中，所述小分子多肽的结构式如式（II）所示：优选地，所述磷酸酶为碱性磷酸酶或酸性磷酸酶。在本专利技术一个实施方案中，所述磷酸酶为碱性磷酸酶。在第二方面，本专利技术提供一种在第一方面所述的基因疫苗载体的制备方法，包括以下步骤：（a）使用Tris缓冲液作为溶剂配置磷酸酶溶液；（b）使用PBS缓冲液作为溶剂配置小分子多肽溶液，调节pH5～9；（c）将所述磷酸酶溶液加入所述小分子多肽溶液，混合均匀，至所述小分子多肽的浓度（w/v）为0.8‰以上，静置以形成超分子水凝胶，即所述基因疫苗载体。在本专利技术一个实施方案中，所述步骤（a）中，所述Tris缓冲液为50mMTris-HCl+1mMMgCl2溶液，所述磷酸酶为碱性磷酸酶，所述碱性磷酸酶的浓度为2U/μL；所述步骤（b）中，所述小分子多肽的结构式如所述式（II）所示，所述小分子多肽溶液的浓度为2‰，用Na2CO3调节pH至9；所述步骤（c）中，所述磷酸酶溶液与所述小分子多肽溶液的体积比为3：100，所述静置为室温静置10min以上。在第三方面，本专利技术提供一种负载有DNA的基因疫苗载体，其包括在第一方面所述的基因疫苗载体及所述基因疫苗载体负载的DNA。优选地，所述DNA包含HIV、乙肝、丙肝和流感病毒中一种或至少两种病毒的蛋白质编码序列。在第四方面，本专利技术提供一种在第三方面所述的负载有DNA的基因疫苗载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）使用Tris缓冲液作为溶剂配置磷酸酶溶液；（2）使用PBS缓冲液作为溶剂配置小分子多肽溶液，调节pH5～9，并加入所述DNA；（3）将所述磷酸酶溶液加入所述小分子多肽溶液，混合均匀，至所述小分子多肽的浓度（w/v）为0.8‰以上，静置以形成超分子水凝胶，即所述负载有DNA的基因疫苗载体。在第五方面，本专利技术提供一种在第三方面所述的负载有DNA的基因疫苗载体作为基因疫苗的应用。优选地，所述应用具体为将所述负载有DNA的基因疫苗载体作为基因疫苗，通过肌肉注射、皮内注射或皮下注射的方式对人或动物进行HIV、乙肝、丙肝和流感病毒中一种或至少两种病毒的免疫。本专利技术的有益效果为：本专利技术在化学合成的小分子多肽的基础上，通过磷酸酶催化形成超分子水凝胶。实验证明：该超分子水凝胶作为基因疫苗载体负载DNA后的免疫原性强、负载量大、没有明显毒性，可通过肌肉注射、皮内注射或皮下注射的方式进行免疫。本专利技术的基因疫苗载体是通过酶促反应制得的，室温下即可进行，因此制备条件温和并且过程简单，不影响DNA的生物活性。本专利技术可应用于HIV、乙肝、丙肝和流感病毒等病毒的基因免疫中。附图说明图1为本专利技术实施例2制备的超分子水凝胶的透射电镜照图，其中放大倍数为30000倍。图2为本专利技术实施例3制备的负载有DNA的基因疫苗载体DNA释放曲线图。图3为本专利技术实施例5基因疫苗载体对抗体的影响实验结果图，其中im表示肌肉注射（intramuscularinjection），id表示皮内注射（intradermalinjection），sc表示皮下注射（subcutaneousinjection），PBS为阴性对照组，Env为无菌水稀释HIVDNA疫苗（pDRVISV1.0-Env）的对照组，G-NMe/Env为本专利技术基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因疫苗载体，其特征在于，所述基因疫苗载体是磷酸酶催化小分子多肽形成的超分子水凝胶，所述小分子多肽的结构式如式（I）所示：其中，m=1时，n=0、1、2或3；n=1时，m=1、2或3。

【技术特征摘要】
1.一种负载有DNA的基因疫苗载体，其特征在于，包括基因疫苗载体及所述基因疫苗载体负载的DNA；所述基因疫苗载体是磷酸酶催化小分子多肽形成的超分子水凝胶，所述小分子多肽的结构式如式(II)所示：2.根据权利要求1所述的负载有DNA的基因疫苗载体，其特征在于，所述磷酸酶为碱性磷酸酶或酸性磷酸酶。3.根据权利要求1所述的负载有DNA的基因疫苗载体，其特征在于，所述基因疫苗载体的制备方法，包括以下步骤：(a)使用Tris缓冲液作为溶剂配制磷酸酶溶液；(b)使用PBS缓冲液作为溶剂配制小分子多肽溶液，调节pH5～9；(c)将所述磷酸酶溶液加入所述小分子多肽溶液，混合均匀，至所述小分子多肽的浓度(w/v)为0.8‰以上，静置以形成超分子水凝胶，即所述基因疫苗载体。4.根据权利要求3所述的负载有DNA的基因疫苗载体，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋兴宇，田月，杨志谋，王怀民，邵一鸣，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11