用于预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的联合抗原和DNA疫苗制造技术

本发明专利技术提供了使用包含RSV抗原和编码所述RSV抗原的DNA的组合来治疗和预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染的症状。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的联合抗原和DNA疫苗序列表本申请包括以ASCII格式提交的并据此整体以引用方式并入的序列表。2012年8月2日创建的ASCII拷贝的名称为“030276-9016_SequenceListing_ST25.txt”，其大小为116,697个字节。
本专利技术涉及使用包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的DNA的组合来治疗和预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染。专利技术背景人RSV属于副黏液病毒科的肺病毒属，是儿童和老年人中下呼吸道感染的主要原因，但在年龄小于三岁的婴幼儿中最常见。在如今的美国，保守的估计表明老年人中每年有大约330万呼吸道疾病病例。与甲型流感病毒疾病相似，RSV在每年冬天流行，在整个一生中反复再次感染RSV非常常见。虽然开发抗RSV的疫苗是一项最优先考虑的工作，但是由于相关的疫苗诱发疾病(VID)尚无安全有效的抗RSV疫苗可用。VID在受试者中因来自RSV抗原的增强的炎性CD4+T细胞反应而由强烈的病原性炎症反应导致。更安全有效的RSV疫苗应当无害并诱导针对病毒的正确的免疫反应。然而，第一种候选疫苗即在20世纪60年代开发的福尔马林灭活RSV(FI-RSV)疫苗在后续自然暴露于病毒后诱发严重的疾病，而不是用作抗感染的疫苗。其导致80％接种疫苗后的婴幼儿入院和两例死亡。得自这些儿童的外周血淋巴细胞表明与原初或RSV感染对照相比的T淋巴细胞高反应性。在用FI-RSV免疫然后用活RSV攻毒的动物模型中揭露了类似的VID发病。小鼠中增强的VID组织病理学变化可通过RSV攻毒前CD4+T细胞或IL-4的去除而消除，从而进一步表明FI-RSV诱导的病理学变化在该动物模型中为T细胞介导的。RSV的F和G蛋白用作重要的中和性和主要的保护性抗原，但是也会导致VID。具体地讲，据发现，用呼吸道合胞病毒(RSV)G糖蛋白(G)免疫的小鼠在RSV攻毒后表现出VID并发生了非典型肺嗜酸性粒细胞增多。CD4+T细胞的去除导致疾病的严重性较轻，从而表明G抗原内的序列可能包含过度刺激T细胞反应的表位。虽然在RSV攻毒时会发生VID的情况下需要RSV疫苗，但是尚未得到可避免进一步导致肺病理学变化的过激反应(诸如VID)的RSV疫苗。理想的抗RSV感染的疫苗应当满足两个要求：1)诱导RSV特异性中和抗体；以及2)不刺激会导致VID的过度T细胞反应。已经测试了许多方法，诸如使用DNA疫苗、腺病毒载体、Th1型佐剂和经口递送，但是迄今为止无一取得成功。因此，本领域需要开发将诱导抗RSV感染的中和抗体但抑制炎性CD4+T细胞的疫苗。专利技术概述本专利技术涉及抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的疫苗，该疫苗包含RSV抗原肽和编码该RSV抗原肽的核酸，其中该疫苗刺激iTreg细胞(CD4+、CD25-、FoxP3+、IL-10+)。该疫苗的RSV抗原肽可以为F糖蛋白、G糖蛋白、SEQIDNO：4(优化的氨基酸RSVG氨基酸序列)、SEQIDNO：25(优化的氨基酸RSVF氨基酸序列)及其功能片段。该疫苗可以具有选自5∶1和1∶5以及1∶1和2∶1的核酸和抗原肽质量比。本专利技术的疫苗可以是核酸。核酸可以是RNA、DNA或cDNA。该核酸编码选自以下的RSV抗原肽：F糖蛋白、G糖蛋白、SEQIDNO：4(优化的氨基酸RSVG氨基酸序列)、SEQIDNO：25(优化的氨基酸RSVF氨基酸序列)及其功能片段。DNA可存在于环形质粒的线性表达盒中。质粒可选自pVAX、pcDNA3.0和proVAX。质粒还可以包含选自以下的启动子：CMV、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子和多角体启动子。本专利技术还涉及包括疫苗施用装置和如上所述的疫苗的疫苗接种试剂盒。试剂盒的疫苗施用装置可以为疫苗枪、针或电穿孔装置。试剂盒可以包括微创电穿孔装置。本专利技术还涉及用于预防或治疗受试者中的呼吸道合胞病毒感染的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如上所述的疫苗。该方法还保护受试者免于发生呼吸道合胞病毒攻毒后的气道高反应性(AHR)。本专利技术还涉及诱导抗呼吸道合胞病毒感染的中和抗体并抑制炎性T细胞的方法，该方法包括向有需要的受试者施用所述疫苗，其中诱导iTreg细胞而抑制自身反应性CD4+和CD8+T细胞。疫苗可通过电穿孔而施用，例如使用微创电穿孔装置，其中电穿孔路径选自皮内和肌内。本专利技术还涉及治疗或预防进行呼吸道合胞病毒(RSV)免疫的受试者中的疫苗诱发疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如上所述的疫苗，其中受试者在遭遇自然RSV感染前已接受了福尔马林灭活RSV(FI-RSV)或RSV抗原的免疫。疫苗可通过电穿孔而施用，例如使用微创电穿孔装置，其中电穿孔路径可以为皮内和肌内。附图简述图1显示了NIH/3T3细胞中的质粒proVAX/G的真核表达。在用proVAX/G转然后48h从NIH/3T3细胞提取了总RNA。用于RT-PCR的模板如下：泳道1，得自具有RT的转染NIH/3T3细胞的cDNA；泳道2，proVAX载体对照转染细胞；泳道3，作为阴性对照的得自非转染NIH/3T3细胞的RNA。图2A-2B显示了在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中重组蛋白表达的SDS-PAGE的考马斯蓝染色。图2A-2B显示了：泳道M，蛋白分子标记；泳道1，未诱导的大肠杆菌BL21(DE3)；泳道2，由IPTG以0.5mM诱导的大肠杆菌BL21(DE3)；泳道3，未诱导的BL21(DE3)pET28a(+)；泳道4，由IPTG以0.5mM诱导的大肠杆菌BL21(DE3)pET28a；泳道5，未诱导的大肠杆菌BL21(DE3)pET28a(+)/G；泳道6和10，由IPTG以0.5mM诱导的大肠杆菌BL21(DE3)pET28a(+)/G；泳道7，纯化的多聚组氨酸标签重组蛋白；泳道8，在0.5mMIPTG诱导下由pET28a(+)/G转化的大肠杆菌BL21(DE3)裂解物的上清液；以及泳道9，在0.5mMIPTG诱导下由pET28a(+)/G转化的大肠杆菌BL21(DE3)裂解物的沉淀物。图3显示了多聚组氨酸标签重组G蛋白的Western印迹分析。大肠杆菌BL21(DE3)裂解物得自在LB肉汤中生长并用0.5mMIPTG诱导的细胞。将蛋白样品在12％SDS-PAGE上分离，然后转移到硝酸纤维素膜。使膜与山羊抗RSV抗体反应，并通过与偶联的抗山羊二抗反应而可视化。泳道1，在0.5mMIPTG诱导下由pET28a(+)/G转化的大肠杆菌BL21(DE3)裂解物的上清液；泳道2，由pET28a(+)/G转染的大肠杆菌BL21(DE3)裂解物的不溶性部分；泳道3，镍柱纯化的重组RSVG蛋白。图4A-4B显示了体液反应的分析。在最后一次免疫后第7天从Balb/c小鼠采集血清样品。使用紫外线灭活的RSV通过ELISA确定RSVG特异性抗体(图4A)和RSVF特异性抗体(图4B)。结果以一式三份的三个组的数据平均值表示，误差条表示标准偏差。所示的数据总结了三个实验之一，它们都展示出相似的结构。单星号表示p＜0.05，双星号表示p＜0.01。图5显示了通过DNA和蛋白疫苗联合免疫诱导了T细胞反应的损本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的疫苗，其包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸，其中所述疫苗刺激iTreg细胞(CD4+、CD25‑、FoxP3+、IL‑10+)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.10 CN 201210030325.51.一种抗呼吸道合胞病毒感染的疫苗，其包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸，其中所述核酸为DNA并且所述DNA编码选自以下的所述RSV抗原肽：SEQIDNO:4和SEQIDNO:25，并且其中所述疫苗刺激iTreg细胞，其中所述iTreg细胞是CD4+CD25-FoxP3+IL-10+iTreg细胞。2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述DNA存在于环形质粒的线性表达盒中。3.根据权利要求2所述的疫苗，其中所述质粒选自pVAX、pcDNA3.0和proVAX。4.根据权利要求2所述的疫苗，其中所述质粒还包含选自以下的启动子：CMV、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子和多角体启动子。5.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述核酸和抗原肽处于选自5:1和1:5、1:1和2:1的质量比。6.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗能够电穿孔到有需要的受试者中。7.一种疫苗接种试剂盒，其包括疫苗施用装置和根据权利要求1所述的疫苗。8.根据权利要求7所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宾，陈璇，俞庆龄，
申请(专利权)人：北京艾棣维欣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11